Bu protokolde, hücre dışı veziküllerin izole edilmesinde etkili zenginleşme için tasarlanmış XO Pad adı verilen kağıt tabanlı bir cihaz imal etmek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. XO Pad, geleneksel yöntemlere göre daha yüksek geri kazanım oranları gösterirken, herhangi bir kimyasal veya iş makinesi kullanmadan hücre dışı vezikülü önceden konsantre ve izole edebilen basit bir cihazdır. Yazıcı yazılımı ile yazdırılacak bölgeyi tanımlayarak başlayın.
Tasarım, dairesel numune alanlarının çaplarının kademeli olarak beş ila iki milimetre arasında daraldığı 12 balmumu desenli katmana sahip olmalıdır. Daha sonra, selüloz kağıdın her iki tarafında belirlenen bölgelerüzerinde hidrofobik balmumu yazdırın. 120 santigrat derece 80 saniye boyunca bir laboratuvar fırınında balmumu baskılı kağıt yerleştirin, sonra bireysel XO Pad cihazlar yapmak için bir kesici ile balmumu baskılı kağıt kesti.
Perma seçici membran beş ve iki mikrolitre sol en ve sağ en katmanları, sırasıyla örnek alanlar üzerine bırakın. Perma seçici membran ile kodlanmış katmanları, çözücünün buharlaşması için 30 dakika boyunca 70 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerine yerleştirin. Daha sonra, tampon çözeltisi ile karşı karşıya kalan kaplamalı tabakanın en dış yüzeyini basınca duyarlı bantla kapatArak küçük bir delik bırakın.
Tüm örnek alanları yakınsak bağlamak için XO Pad cihazını beyaz çizgiler boyunca ileri geri katlayın. Pipet 15 mikrolitre mikrolitre mikrovezi ve ekzozom numunesi yakınsak numune alanlarında ve tam ıslatma sağlamak için birkaç saniye bekleyin. XO Pad'in her iki ucuna iki akrilik oda yerleştirin ve açılmayı önlemek için küçük bağlayıcı klipslerle güvenli bir şekilde kenetleyin.
Odaları 0,1X PBS'nin 110 mikrolitresi ile doldurun ve iki gümüş elektrot takın. Daha sonra elektrotlara 20 dakika boyunca 30 volt uygulamak için bir akım gerilim kaynak ölçüm sistemi kullanın. Zenginleştirilmiş mikrovezikülleri ve ekzozomları izole etmek için katlanmış XO Pad'i akrilik bölmelerden ayırın ve diğer katmanlardan zenginleştirilmiş parçacıkları izole etmek için cihazı açın.
Mikroveziküllerin ve ekzozomların aşağı analiz için zenginleştiği 8 ve 9. Zenginleştirilmiş partiküllerin maksimum geri kazanımı için çalışma süresini optimize etmek için floresan etiketli mikroveziküllerin ve ekzozomların hızlandırılmış geçiş tayini yapıldı. Tüm örnek lem alanlarındaki floresan yoğunlukları ImageJ yazılımı ile ölçüldü.
Zenginleştirme sürecinden önce mikroveziküller ve ekzozomlar tüm numune alanlarına dağıldı ve yoğunluk giderek azaldı. İşlemden 10 dakika sonra parçacıklar elektro-kinetically göç etti ve anında bir ön konsantrasyon fişi katman yedi çıktı. Zaman 20 dakika ulaştığında, mikroveziküller ve ekzozomlar güçlü katmansekiz ve dokuz üzerinde duruldu ve floresan yoğunlukları dayalı beş kat zenginleştirilmiştir.
8. tabakadaki zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların bütünlüğü SEM ile araştırıldı. zenginleştirme işleminden sonra önemli ölçüde daha fazla hasarsız partikül gözlendi. Zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların boyut dağılımı da analiz edildi.
Daha sonra, zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların örnek alanlar üzerindeki gerçek konsantrasyonu altı, sekiz ve 10'daki katmanlarda analiz edildi. Sekizinci tabakada mikroveziküller ve ekzozomlar 5.58 faktörüyle önceden konsantre edildi, ancak diğer katmanlarda gözle görülür bir ön konsantrasyon gözlenmedi. Bu yordamın tekrarlanabilirliğini sağlamak için, cihaz doğrulaması ve cihaz çalışma süresi sırasında fırın kuluçka süresi ve sıcaklığı için protokolü tam olarak takip edin, çünkü bunlar optimize edilmiş koşullardır.
XO Pad ayrıca hücre dışı vezikülü serum veya plazma gibi protein açısından zengin örneklerden karbonat tamponu kullanarak ayırmak ve izole etmek için de kullanılabilir. Bu protokol, tanı, ilaç dağıtımı, immünoterapi ve diğer terapötikler gibi klinik araştırmalar için gerekli olan ön konsantre ve izole yetenekleriyle etkin ve basit bir hazırlık aracı sağlayabilir.
