Эти методы могут обеспечить механистическое понимание иммунной клетки опосредовано цитотоксии опухолевых клеток и инвазивного поведения в 3D условиях. Основным преимуществом этой техники является то, что эта 3D-модель со-культуры сфероидов не требует передачи сфероидов для нескольких последующих эссе. Демонстрацией этой процедуры будет Апсра Насир, аспирантка нашего факультета.
Для создания сфероидов с помощью асептической техники в капюшоне клеточной культуры добавьте 500 микролитров расплавленной агарозы в 81 микроуэлл резиновой плесени, заботясь, чтобы избежать пузырьков. Когда агароза затвердевла тщательно гибкой резиновой плесени выскочить агарозы бросает в отдельных скважин 12 хорошо пластины. Чтобы уравночные слепки добавить 2,5 миллилитров клеточной культуры среды дополняется 10%плода бычьей сыворотки в каждом хорошо и поместить пластину в инкубатор клеточной культуры в течение одного часа.
В конце инкубации наклона пластины, чтобы удалить клеточной культуры среды в окружающей сначала, то в камере посева и тщательно семян 190 микролитров готовы к опухолевых клеток подвески dropwise в каждой камере посева клеток. После 15-минутной инкубации в инкубаторе клеточной культуры добавьте 2,5 миллилитров среды к внешней стороне отлитого и верните пластину в инкубатор на 48 часов. Для того чтобы установить T-клетку co-культура resuspend сооместимое число T-клеток в 190 microliters неуместной культуры T-клетки, средств в наилучшим образом до 12 well-plate для того чтобы позволить удаление среды культуры клетки окружая agarose бросаемое сперва.
Затем в камере посева, не удаляя сфероиды использовать световой микроскоп, чтобы проверить, являются ли какие-либо сфероиды были аспирированы и проведение P200 загружены пипетки около половины сантиметра над каждым литые тщательно семян Т-клеток на слепки в dropwise моды, не вытесняя сфероидов. Когда все слепки были посеяны тщательно вернулся пластины в инкубатор культуры клеток в течение 15 минут, прежде чем добавить свежие клетки культуры среды дополняется плода бычьего сыворотки на внешней стороне каждого литого еще 48 часов инкубации. Для встраивания 3D-ко-культур в коллагеновый коллаген типа 1 коллаген разбавляют коллаген сывороткой свободной базовой среды до конечной рабочей концентрации в три миллиграмма на миллилитр и добавляют 11 микролитров 10X PBS, добавьте 1,2 микролитров одного гидроксида натрия на 100 микролитров коллагена.
После нейтрализации раствора коллагена на льду в течение одного часа, удалить клеточной культуры среды окружающих и внутри каждого литого, как попродемонстрировано. Аккуратно добавьте нейтрализованный коллаген по одной смеси к каждому отлитому в капле, и сразу же вернули пластину в инкубатор клеточной культуры в течение пяти минут, прежде чем инвертировать пластину еще на один час в инкубации. В конце инкубации поместите пластину правой стороной вверх в биобезопасности капот и медленно добавить свежие клетки культуры среды вниз стороне каждого хорошо.
Затем верните пластину в инкубатор клеточной культуры на 48 часов. Для иммунофторесцентного окрашивания встроенных 3D-ко-культур исправить каждый весь агарозы литой в том числе сфероидов в 5,4% формалин ночь при комнатной температуре во влажной камере. На следующий день, удалить формалин окружающих агарозы литые и использовать гладкий кончик пинцета, чтобы захватить угол каждой коллагеновой матрицы, чтобы слепки, которые будут очищены от посевных камер в одном движении жидкости.
Поместите каждый коллаген патч в один колодец из восьми хорошо камеры слайда и добавить 250 микролитров 0,5%octoxynol все к каждому хорошо. Через час при комнатной температуре замените октоксинол 250 микролитров блокирующего раствора. После одного часа при комнатной температуре добавьте 250 микролитров основного коктейля антител, представляющих интерес для каждого хорошо и поместите слайд в темной увлажненной камере на ночь при комнатной температуре.
На следующее утро удалить первичные антитела из каждой скважины и мыть скважины три раза с 300 микролитров буфера ЕСЛИ в течение пяти минут при комнатной температуре за стирку. После последней стирки добавьте 250 микролитров неправильного вторичного раствора антител к каждому колодец в течение одного часа инкубации при комнатной температуре, защищенной от света. В конце инкубации удалить антитела и мыть каждый образец три раза с буфером IF, как попродемонстрировано.
После последней стирки промыть образцы с 300 микролитров PBS на колодец и тщательно удалить стенки камеры слайда. Так что остается только стеклянная горка внизу. Добавить 200 микролитров монтажной среды к стеклянной слайд и тщательно падение крышки скольжения на образец без создания пузырьков затем хранить установленные образцы в темном сухом месте на ночь перед изображением конфокальные флуоресценции микроскопии Здесь типичные экспериментальные установки для анализов, и они дают репрезентативные и анализируемые образцы в конце эксперимента для каждого протокола можно наблюдать.
Встраивание 3D-культуры в коллаген типа 1 в микро колодцы агарозного литого позволяет контролировать и анализ вторжения по изображению J.In этот анализ двух первичных мурина, линии раковых клеток поджелудочной железы различных форм сфероидов и инвазивного поведения наблюдались. Первая клеточная линия продемонстрировала более компактное образование сфероидов и колючее вторжение, аналогичное тому, которое наблюдалось при вторжении одной клетки. В то время как вторая клеточная линия сформировала сфероиды, которые были более рыхлыми и продемонстрировали коллективную модель вторжения.
Со-культура может быть выполнена с двумя различными линиями клональных клеток опухоли, посеянных в то же время или с опухолью и Т-клеток при образовании опухоли сфероидов или последующей опухоли Т-клеток оценки взаимодействия. Для детальной оценки инвазивного поведения иммунофлуоресцентное окрашивание и конкоцентрическая визуализация могут быть выполнены в высокой пропускной способности образом. Агарозный слепок позволяет встраивать всю систему 3D-культуры в парафин для последовательного сечения и окрашивания иммуногистохимии для количественной оценки пространственной взаимосвязи между опухолью и Т-клетками.
Например, проникновение Т-клеток может быть идентифицировано и характеризуется окрашивание маркера поверхности клетки. Этот метод позволяет анализ образцов пациента, а также использование стимулирующих и блокирующих препаратов для зондирования опухолевых клеток Т-клеток взаимодействий.
