שיטות אלה יכולות לספק תובנות מכניסטיות על ציטוטוקסיות של תאי הגידול התיווך בתאי החיסון והתנהגות פולשנית בסביבה תלת-מימדית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי מודל זה 3D ספרואיד תרבות שותף אינו דורש העברה של כדוריות עבור מאמרים רבים הבאים. הפגנת הליך זה תהיה אפסרה נאסיר, דוקטורנטית מהמחלקה שלנו.
כדי ליצור את הכדורואידים באמצעות טכניקה אספטית במכסה המנוע של תרבות התא להוסיף 500 microliters של אגת מותכת לתוך עובש גומי 81 microwell דואג להימנע בועות. כאשר agarose התגבש בזהירות להגמיש את עובש הגומי כדי לפוצץ את יציקות אגרוז לתוך בארות בודדות של צלחת 12 היטב. כדי לצייד את הגבס להוסיף 2.5 מיליליטר של מדיום תרבות התא בתוספת 10% סרום חזיר עוברי לתוך כל באר ולמקם את הצלחת לתוך אינקובטור תרבות התא במשך שעה אחת.
בסוף הדגירה להטות את הצלחת כדי להסיר את מדיום תרבות התאים בסביבה הראשונה, לאחר מכן בתא הזריעה בזהירות זרע 190 microliters של מוכן גידול מתלים התא dropwise לתוך כל תא זריעת תא. לאחר אינקובציה של 15 דקות באינקובטור תרבות התא להוסיף ב 2.5 מיליליטר של בינוני לחוץ של הגבס ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור במשך 48 שעות. כדי להקים תא T-תא שיתוף תרבות resuspend את המספר המתאים של תאי T ב 190 microliters של תרבות תא T לא הולם, בינוני ל הבאר עד 12 גם צלחת כדי לאפשר הסרה של מדיום תרבות התא סביב יצוק agarose הראשון.
ואז בתא הזריעה, מבלי להסיר את הכדורידים להשתמש במיקרוסקופ אור כדי לבדוק אם כל כדוריות כבר שאפו ומחזיק פיפטה טעון P200 כחצי סנטימטר מעל כל יצוק בזהירות לזרוע את תאי T על הגבס בצורה dropwise מבלי לנתק את כדוריות. כאשר כל הגבסים כבר זרעו בזהירות החזיר את הצלחת לחממת תרבות התא במשך 15 דקות לפני הוספת בינוני תרבות תאים טריים בתוספת סרום חזיר עוברי לצד החיצוני של כל גבס עוד 48 שעות דגירה. כדי להטמיע את תרבות שיתוף 3D בסוג אחד קולגן לדלל קולגן מלאי עם בסיס חופשי בסרום בינוני לריכוז עבודה סופי של שלושה מיליגרם למיליליטר ולהוסיף 11 microliters של 10X PBS, להוסיף 1.2 microliters של נתרן הידרוקסידית אחת טוחנת לכל 100 microliters של קולגן.
לאחר נטרול ת פתרון הקולגן על הקרח למשך שעה אחת, הסר את מדיום תרבות התאים המקיפה ובתוך כל גבס כפי שהוכח. מוסיפים בזהירות את הקולגן המנוטרל תערובת אחת לכל גבס בצורה dropwise, ומיד החזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא במשך חמש דקות לפני היפוך הצלחת במשך שעה נוספת הדגירה. בסוף הדגירה מניחים את הצלחת בצד ימין למעלה במכסה המנוע biosafety ולאט לאט להוסיף מדיום תרבות תאים טריים לאורך הצד של כל באר.
ואז להחזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא במשך 48 שעות. עבור כתמים immunofluorescent של תרבויות 3D מוטבע לתקן כל יצוקה אגרוז כולל כדוריות ב 5.4% פורמלין לילה בטמפרטורת החדר בתא לח. למחרת, להסיר את הפורמלין המקיף את הגבס אגרוז ולהשתמש פינצטה קצה מלוטש לתפוס את הפינה של כל מטריצת קולגן כדי לאפשר את הגבס להיות קלוף מן תאי הזריעה בתנועת נוזל אחת.
מניחים כל תיקון קולגן לתוך באר אחת של שמונה שקופית תא היטב ולהוסיף 250 microliters של 0.5% octoxynol כל טוב. לאחר שעה בטמפרטורת החדר להחליף את octoxynol עם 250 microliters של פתרון חסימה. לאחר שעה בטמפרטורת החדר מוסיפים 250 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים העיקרי המעניין כל באר ומ מניחים מגלשה בתא לח כהה לילה בטמפרטורת החדר.
למחרת בבוקר להסיר את הנוגדן העיקרי מכל באר ולשטוף את הבארות שלוש פעמים עם 300 microliters של חיץ IF במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו 250 מיקרוליטרים של תסנובות משניות לא הולמות לכל באר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. בסוף הדגירה להסיר את הנוגדן ולשטוף כל מדגם שלוש פעמים עם מאגר IF כפי שהוכח.
לאחר הכביסה האחרונה לשטוף את הדגימות עם 300 microliters של PBS ל הבאר בזהירות להסיר את הקירות של השקופית התא. כך שרק מגלשת הזכוכית בתחתית נשארת. הוסף 200 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה לשקופית הזכוכית ושחרר בזהירות את החלקת הכיסוי על המדגם מבלי ליצור בועות ואז לאחסן את הדגימות המותקנות במקום יבש כהה לילה לפני הדמיה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי קונפוקלית כאן ניתן לראות הגדרות ניסיוניות טיפוסיות עבור הראיה והן מניבות דגימות מייצגות ונותנות לניתוח בסוף הניסוי עבור כל פרוטוקול.
הטמע תרבות 3D בקולגן מסוג אחד בתוך בארות מיקרו של יצוקה אגרוז מאפשר ניטור וניתוח של הפלישה על ידי תמונה J.In ניתוח זה של שני מורין ראשי, תאי סרטן הלבלב קווים צורות כדוריות שונות והתנהגויות פולשניות נצפו. קו התא הראשון הפגין היווצרות ספרואידית קומפקטית יותר ופלישה חדה דומה לזו שנצפתה בפלישה לתא יחיד. בעוד קו התא השני יצר כדוריות שהיו משוחררות יותר והפגינו דפוס פלישה קולקטיבי.
שיתוף תרבות יכול להתבצע עם שני קווי תאים שיבוט הגידול שונים זרע באותו זמן או עם גידול ותאי T על היווצרות ספרואיד הגידול או הערכות אינטראקציה גידול T-cell הבאים. להערכה מפורטת של הכתם האימונופלואורסצנטי של ההתנהגות הפולשנית והדמיה קון מוקדית ניתן לבצע באופן תפוקה גבוהה. הגבס אגרוז מאפשר הטממה של כל מערכת התרבות 3D בפרפין עבור חתך סדרתי וכתמים אימונוהיסטוכימיה לכמת את הקשר המרחבי בין הגידול לתאי T.
לדוגמה, חדירת תאי T יכולה להיות מזוהה ומאופיינת על ידי כתמי סמן פני השטח של התא. טכניקה זו מאפשרת ניתוח של דגימות המטופל, כמו גם את השימוש בתרופות מגרה וחסימה כדי לחקור אינטראקציות תא גידול T-cell.
