Diese Methoden können mechanistische Einblicke in immunzellvermittelte Tumorzellzytotoxizität und invasives Verhalten in einer 3D-Einstellung liefern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass dieses 3D-Sphäroid-Cokulturmodell nicht die Übertragung von Sphäroiden für mehrere nachfolgende Essays erfordert. Demonstriert dieses Verfahren wird Apsra Nasir, eine Doktorandin aus unserer Abteilung.
Um die Sphäroide mit aseptischer Technik in einer Zellkulturhaube zu erzeugen, fügen Sie 500 Mikroliter geschmolzener Agarose in eine 81 Mikrowell-Gummiform ein, die darauf achtet, Blasen zu vermeiden. Wenn die Agarose gefestigt hat, beugen Sie vorsichtig die Gummiform, um die Agarosegussteile in einzelne Brunnen einer 12-Well-Platte herauszuspringen. Um die Abgüsse zu equilibrate fügen 2,5 Milliliter ZellkulturMedium mit 10% fetalem Rinderserum in jeden Brunnen ergänzt und legen Sie die Platte in einen Zellkultur-Inkubator für eine Stunde.
Am Ende der Inkubation kippen Sie die Platte, um zuerst das Zellkulturmedium in der Umgebung zu entfernen, dann in der Säkammer und säen sie vorsichtig 190 Mikroliter der vorbereiteten Tumorzellsuspension tropfenweise in jede Zellsäkammer. Nach einer 15-minütigen Inkubation im Zellkultur-Inkubator mit 2,5 Millilitern Medium an die Außenseite des Gusses geben und die Platte für 48 Stunden an den Inkubator zurückgeben. Um eine T-Zell-Kokultur einzurichten, setzen Sie die entsprechende Anzahl von T-Zellen in 190 Mikroliter nder ungeeigneter T-Zell-Kultur wieder auf, Medium pro Brunnen bis zur 12 Well-Platte, um die Entfernung des Zellkulturmediums um die Agarose zuerst zu ermöglichen.
Dann in der Säkammer, ohne die Sphäroide zu entfernen, verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um zu überprüfen, ob Sphäroide angesaugt wurden und halten Sie die P200 geladene Pipette etwa einen halben Zentimeter über jedem Guss sorgfältig säen die T-Zellen auf die Gussteile in einer tropfenweise Weise, ohne die Sphäroide zu vertreiben. Wenn alle Abgüsse ausgesät wurden, gab die Platte sorgfältig an den Zellkultur-Inkubator für 15 Minuten zurück, bevor sie frisches Zellkulturmedium hinzufügte, das mit fetalem Rinderserum an der Außenseite jedes Gusses für eine weitere 48-stündige Inkubation ergänzt wurde. Um die 3D-Kokulturen in Typ eins Kollagen verdünnt Eskollagen mit serumfreiem Basismedium auf eine endgültige Arbeitskonzentration von drei Milligramm pro Milliliter einzubetten und 11 Mikroliter 10X PBS hinzuzufügen, fügen Sie 1,2 Mikroliter eines Molaren-Natriumhydroxids pro 100 Mikroliter Kollagen hinzu.
Nach der Neutralisierung der Kollagenlösung auf Eis für eine Stunde, entfernen Sie die Zellkultur Medium umgeben und in jedem Guss wie gezeigt. Fügen Sie das neutralisierte Kollagen vorsichtig tropfenweise zu jedem Guss hinzu und geben Sie die Platte sofort für fünf Minuten an den Zellkultur-Inkubator zurück, bevor Sie die Platte für eine weitere Stunde in der Inkubation umkehren. Am Ende der Inkubation die Platte rechts oben in die Biosicherheitshaube legen und langsam ein frisches Zellkulturmedium an der Seite jedes Brunnens hinzufügen.
Dann geben Sie die Platte für 48 Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurück. Für die immunfluoreszierende Färbung der eingebetteten 3D-Kokulturen fixieren Sie jeden gesamten Agaroseguss einschließlich der Sphäroide in 5,4% formalin über Nacht bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer. Am nächsten Tag entfernen Sie das Formalin, das den Agaroseguss umgibt, und verwenden Sie eine schlanke Spitzenpinzette, um die Ecke jeder Kollagenmatrix zu erfassen, damit die Gussteile in einer einzigen Flüssigkeitsbewegung aus den Säkammern geschält werden können.
Legen Sie jedes Kollagen-Patch in einen einzigen Brunnen einer acht Wellkammerrutsche und fügen Sie 250 Mikroliter 0,5%Octoxynol alle zu jedem Brunnen hinzu. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur das Octoxynol durch 250 Mikroliter Blockierlösung ersetzen. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur 250 Mikroliter des primären Antikörpercocktails hinzufügen, der für jeden Brunnen von Interesse ist, und eine Rutsche über Nacht bei Raumtemperatur in eine dunkle befeuchtete Kammer legen.
Am nächsten Morgen den primären Antikörper aus jedem Brunnen entfernen und die Brunnen dreimal mit 300 MikroliterIF-Puffer für fünf Minuten bei Raumtemperatur pro Waschgang waschen. Nach der letzten Wäsche, fügen Sie eine 250 Mikroliter unangemessene sekundäre Antikörperlösung zu jedem Brunnen für eine Stunde Inkubation bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation den Antikörper entfernen und jede Probe dreimal mit IF-Puffer waschen, wie gezeigt.
Nach dem letzten Waschen spülen Sie die Proben mit 300 Mikroliter PBS pro Brunnen und entfernen Sie vorsichtig die Wände der Kammerrutsche. Damit nur noch die Glasrutsche unten bleibt. Fügen Sie 200 Mikroliter Montagemedium auf die Glasrutsche und vorsichtig fallen die Abdeckung Slip auf die Probe, ohne Blasen zu schaffen dann speichern Sie die montierten Proben an einem dunklen trockenen Ort über Nacht vor der Bildgebung durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie Hier typische experimentelle Setups für die Assays und sie ergeben repräsentative und analyzierbare Proben am Ende des Experiments für jedes Protokoll beobachtet werden.
Die Einbettung der 3D-Kultur in Typ-eins-Kollagen in die Mikrobrunnen eines Agarose-Gusses ermöglicht die Überwachung und Analyse der Invasion durch Bild J.In diese Analyse von zwei primären murinen, Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien verschiedene Sphäroidformen und invasive Verhaltensweisen beobachtet wurden. Die erste Zelllinie zeigte eine kompaktere Sphäroidbildung und stachelige Invasion ähnlich der bei Einzelzellinvasionen beobachteten. Während die zweite Zelllinie Sphäroide bildete, die lockerer waren und ein kollektives Invasionsmuster zeigten.
Die Co-Kultur kann mit zwei verschiedenen tumorklonalen Zelllinien durchgeführt werden, die gleichzeitig gesät werden, oder mit Tumor- und T-Zellen bei Tumorsphäroidbildung oder einer anschließenden Tumor-T-Zell-Interaktionsauswertung. Für eine detaillierte Beurteilung des invasiven Verhaltens können immunfluoreszierende Färbungen und konfokale Bildgebung in hoher Durchsatzweise durchgeführt werden. Der Agaroseguss ermöglicht die Einbettung des gesamten 3D-Kultursystems in Paraffin für serielle Schnitte und immunhistochemische Färbung, um die räumliche Beziehung zwischen Tumor und T-Zellen zu quantifizieren.
Beispielsweise kann die T-Zell-Infiltration identifiziert und durch Zelloberflächenmarkerfärbung charakterisiert werden. Diese Technik ermöglicht die Analyse von Patientenproben sowie die Verwendung von stimulierenden und blockierenden Medikamenten zur Untersuchung von Tumorzell-T-Zell-Wechselwirkungen.
