Этот протокол обеспечивает пошаговую процедуру для обнаружения радиационно-индуцированных очагов ремонтных белков путем иммунофлюоресценции окрашивания в линиях раковых клеток толстой кишки человека после облучения нейтронно-смешанным лучом. Иммунофлуоресценция изображения является чувствительным методом и обеспечивает визуальное доказательство появления белка пути ремонта в очагах в ответ на повреждения ДНК-агентов, как ионизирующее излучение. Нейтронно-смешанный луч используется в борной нейтронной терапии захвата, BNCT, и радиационно-индуцированной реакции повреждения ДНК не была полностью установлена.
Наш протокол также может быть полезен для анализа биологических эффектов на клеточном уровне из-за излучения другими высоколетными лучами, такими как протоны с помощью протонной лучевой терапии или ионов углерода с использованием адроновой терапии. После облучения, удалить среду из прикрепленных клеток, и мыть их один раз с 2,5 миллилитров PBS. Затем исправить клетки с одним миллилитр 70% этанола в течение 10 минут.
Чтобы пронизать клетки, удалить этанол, и мыть их с 2,5 миллилитров PBS. Аккуратно добавьте один миллилитр 2%Triton X-100 в PBS, чтобы покрыть крышки, и инкубировать клетки в течение пяти минут при комнатной температуре. Вымойте клетки три раза с PBS, и блокировать протеабилизацию с одним миллилитр 2%BSA разбавленной в PBS.
Затем инкубировать клетки в течение как минимум 30 минут с 2%BSA. Чтобы испачкать клетки, добавьте надлежащее количество первичных антител, разбавленных в PBS с BSA, как это рекомендовано в рукописи текста. Затем накройте чашку Петри и поместите ее в пластиковую коробку с увлажненным лигнином для поддержания влажности.
Инкубировать его в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию. После инкубации, выполнить три моет с PBS, и добавить надлежащее количество вторичных антител. Верните блюдо в пластиковую коробку с увлажненным лигнином и инкубировать его в течение не менее 30 минут при 37 градусах цельсия.
Затем повторите моет с PBS, и добавить 100 микролитров DAPI разбавленной до окончательной концентрации одного микрограмма на миллилитр, чтобы противостоять ядрам. Инкубировать клетки в течение максимум двух минут при комнатной температуре, и повторить моет с PBS. После последней стирки снимите PBS и аккуратно положите крышку поверх монтажной среды, избегая образования пузырьков воздуха.
Печать края крышки с лаком для ногтей, и позволяют монтажа среды затвердеть перед выполнением флуоресценции микроскопии. Гамма-H2AX очаги, которые являются стандартными маркерами для ДНК двухместных перерывов, были обнаружены в нейтронных смешанных, луч облученных и необлученных раковых клеток толстой кишки. Очаги отображаются как различные флуоресцентные точки.
В облученных клетках наблюдался более высокий диаметр гамма-H2AX foci. Кроме того, был обнаружен один трек альфа-частицы с высоким LET, пересекающий ядра. Иммунофлюоресценция микроскопии была использована для обнаружения репрезентативных ремонтных белков Rad52 и ДНК-зависимой белковой киназы.
Высокое среднее значение ДНК-зависимого диаметра киназы белка было измерено при разрыве ДНК после облучения по сравнению с контрольными клетками. Кластерные двойные разрывы ДНК наблюдались в облученных клетках как более сложные, большие и кластерные очаги с более высокой интенсивностью. Наиболее важным этапом окрашивания иммунофлуоресценции является фиксация клеток и проницаемость клеточной мембраны.
Эти шаги необходимы для того, чтобы антитела легко проникали как в эти клетки, так и внутриклеточные ремонтные белки. Эта процедура дает информацию об активации каждого пути ремонта на клеточном уровне. Результаты должны быть подтверждены на молекулярном уровне с помощью анализа, таких как ПЦР в режиме реального времени.
Этот метод позволяет исследователям исследовать радиационно-индуцированной реакции повреждения ДНК, которая не была полностью определена в случае различных лучей с использованием противораковых методов лечения.
