Косвенная иммунофлуоресценция позволяет обнаруживать белки ДНК, фотографии пространственного и временного набора и помогает допрашивать взаимодействия протеинпротеина в месте повреждения ДНК. После повреждения ДНК, белки восстановления ДНК набираются на оскорбление ДНК, в то время как их концентрация увеличивается локально, и они образуют группы, называемые очагами, которые могут быть визуализированы косвенным иммунофлюоресценцией на фиксированных образцах. Этот метод может быть использован для обнаружения белковых очагов, а также для количественной оценки колокализации настоящего в клетках.
Это может помочь объяснить последовательность событий, необходимых для сложного формирования и для восстановления ДНК. определенные взаимодействия proteinprotein могут быть повлекли за собой от таких экспериментов. Демонстрация процедуры будет Барбара Де Ла Пена, очень талантливый Postdoc Фото из моей лаборатории Начните с ростом 40000 клеток HeLa в каждом более чем 12 хорошо пластины с 18 миллиметров круглые стеклянные крышки до 80% слияния.
После разоблачения клеток до четырех серых гамма-облучения, мыть их дважды с одним миллилитров PBS. Затем удалите PBS полностью и добавить 200 микролитров NDB к каждой хорошо. Инкубировать клетки в течение двух минут при комнатной температуре, а затем удалить NDB.
Имейте в виду, что время инкубации может варьироваться в зависимости от линии ячейки, но, как правило, не должно превышать двух минут. Вымойте клетки одним миллилитром PBS. Затем удалите PBS полностью и добавить 200 микролитров 4%PFA к каждому хорошо для фиксации клеток.
Инкубировать клетки в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию. Затем удалите PFA и добавить один миллилитр PBS к каждой хорошо. Удалите PBS полностью, а затем добавить 200 микролитров блокирующего раствора для каждой хорошо и инкубировать клетки в течение двух часов при комнатной температуре или от 16 до 18 часов при четырех градусах по Цельсию.
разбавить первичные антитела и разбавления буфера и вихрь его до тех пор, пока хорошо смешанные в коробке влажности и здесь кусок парафильма и добавить 10 микролитров первичного антитела в одну каплю. Выровнять один край крышки из хорошо с падением и медленно опустите его на парафильм распространения жидкости. инкубировать крышку в течение двух часов при комнатной температуре.
После инкубации мыть крышку скользит три раза в PBS в течение одной минуты за стирку. разбавить вторичное антитело и буфер разбавления и вихрь его до тех пор, пока хорошо смешанные применять 10 микролитров вторичных антител к каждому coverslip как описано ранее и инкубировать его в течение двух часов при комнатной температуре защищены от света. Вымойте крышку скользит три раза с PBS и один раз с водой в течение одной минуты за стирку.
Затем смонтировать их на стеклянные горки с глицеролом на основе монтажа средств массовой информации, содержащей DAPI уплотнения крышка скользит с прозрачным лаком для ногтей и дайте им высохнуть в течение 20 минут. Поместите каплю масла погружения на объектив 60 x и используйте DAPI, чтобы найти ядра через окуляр для приобретения изображения XY, откройте программное обеспечение для приобретения и установите тип сканера как гальвано типа сканера как туда и обратно и 512 на 512 размер изображения. В режиме панели PMT для среднего VBM для кадра и последовательного сканирования для строки.
Далее установите красителя и тепла детекторы установить канал один для DAPI и SD один, канал два alexafluor 488 и HSD три, и канал три alexafluor на 647 и HSD четыре выбрать на Z.To настроить живое изображение, нажмите кнопку в прямом эфире на живое окно и настроить фокус. Затем используйте окно инструмента PMT, чтобы установить чувствительность лазерной интенсивности, получить и компенсировать для стеков z, выберите от начала до конца и 15 ломтиков. Выберите папку для сохранения изображений и нажмите кнопку LSM Start, чтобы начать приобретение.
После завершения, нажмите кнопку серии сделали, чтобы завершить получение изображения. Откройте программное обеспечение для анализа, затем нажмите на окно пакетного инструмента и выберите изображения для анализа. Перейдите в окно инструмента анализа и выберите проекцию, которая будет отображать максимальную интенсивность проекции из 15 ломтиков.
В настройках вывода ввода выберите созданную папку пакетов и выходных данных. Процесс прессы для обработки изображений и экспорта изображений в качестве файлов TIFF. Выполните ядерную количественную оценку с помощью клеточного профилера в соответствии с рукописными указаниями.
Клетки, не обработанные радиацией, демонстрируют очень мало гамма-знака H2AX. При отсутствии необходимых белков восстановления ДНК, накопление гамма H2AX можно наблюдать при разрыве ДНК. Накопление невосстановимых разрывов может привести к тому, что клетки станут до гипотоническими, указанными твердыми ядрами гамма-H2AX.
После облучения ядра имеют большое количество двойных разрывов, к которым гамма H2AX локализуется чрезвычайно быстро. Хотя мало, если какие-либо очаги наблюдаются в отсутствие излучения количество очагов было количественно на один два четыре и 16 часов после излучения и для контроля радиации НОА. В зависимости от биологического вопроса и типа требуемых данных, различные варианты построения должны быть рассмотрены Колокализация может быть исследована путем мультиплексирования первичных антител, поднятых в различных видов животных и с использованием вторичных антител, помечены различными фторфорами.
Суперпозиция зеленого и красного, порождает желтые горячие точки, два белка, представляющие интерес присутствуют в тех же пикселей. Количественный анализ колокализации может быть достигнут с помощью подхода, основанного на объекте, или статистического подхода, который выполняет анализ коэффициента интенсивности. Сочетание первичных антител, поднятых в различных видах животных, могут быть использованы в этом протоколе.
Убедитесь, что антитела совместимы и не будут мешать друг другу. Вы должны надлежащим образом установить вторичное антитело, которые будут использоваться против каждого из основных антител и рассмотреть конкретные спектральные перекрытия при выборе меньше силы, которые будут использоваться. Колокализация или белки указывают на возможные прямые взаимодействия.
Это может быть проверено гранулированными осадками в клетках, или прямым положить вниз с помощью очищенных белков in vitro.
