Конфокальная томография была разработана для получения полной гаммы поведения раковых клеток, так как они взаимодействуют с клеточным барьером и нишей. Этот метод обеспечивает основу для изучения метастазов, как они происходят. Этот подход полезен для количественной оценки поведения живых клеток.
Конфокальная томография в сочетании с машинным обучением полезна для различных платформ с органом на чипе. Анализ первичной или рецидивирующей опухоли или циркулирующих опухолевых клеток может представлять собой важный диагностический инструмент для прогнозирования метастазов в мозг и для распознавания метастатических мозгов из метастатических клеток мозга. Чтобы собрать микрофлюидное устройство BBN, перенесите устройство из вакуумного децикатора на соответствующую поверхность с входами вниз и поместите всю установку в плазменную камеру.
Поместите всю установку в плазменную камеру и потяните вакуум перед лечением устройства плазмой в течение 30 секунд при 80 Вт. В конце лечения используйте руководство, чтобы быстро разместить устройство, введать сторону вверх на стеклянную горку на лабораторной скамейке, чтобы создать постоянную связь между ДПМ устройства и слайда. Затем вставьте 200 микролитровых пипеток, вырежьте два миллиметра от кончика во все входы и розетки и поместите устройство в плазменную камеру на 8 минут 200 ватт плазменной обработки.
После охлаждения устройства поместите устройство в стерильный вторичный контейнер и в течение 15 минут после плазмидной обработки перенесите 120 микролитров раствора коллагенового астроцита в устройство через наконечник пипетки для нижней камеры. Разрешить решение фитиль через камеру в противоположную наконечник пипетки и заполнить следующий канал устройства. Когда все четыре канала устройства были заполнены, поместите чип в инкубатор культуры клеток в течение одного часа.
Когда коллаген установил, счет все советы пипетки кормления нижней камеры с соответствующей полной среды клеточной культуры и пальто верхней палаты с 2%фактор роста снижение matrigel, в полной эндотелиальной среде. Когда обе камеры были закодированы, поместите устройство в инкубатор в течение одного часа, прежде чем полоскать верхнюю камеру соответствующей средой. Чередуя советы, см. 30 микролитров от одного раза 10 до шестого эндотелиальных клеток на миллилитр соответствующей среды, через кончики в верхней камере каждые 15 минут, в общей сложности четыре aliquots клеток на кончик.
Инкубировать устройство между посевами. Когда все эндотелиальные клетки были посеяны, заполнить все советы со средой и вернуть устройство в инкубатор культуры клеток в течение 48 часов. Когда эндотелиальный слой созрел, замените среду в чипе, чтобы пополнить среду клеточной культуры и посеять каждый верхний камерный канал с 30 микролитров один раз от 10 до шести раковых клеток на миллилитр соответствующей среды.
После каждого 30 микролитер aliquot клеток был посеян, вернуть устройство в инкубатор в течение 15 минут, а затем заполнить все советы с соответствующей среде вернуть устройство в инкубатор культуры клеток в течение 24 до 48 часов. После того, как устройство было культурно и изображение, для измерения фенотипа раковых клеток, открыть предоставленное программное обеспечение и читать конфокальные изображения в память. Программное обеспечение сохранит каждый цветной канал от 3D конфокального изображения в отдельный файл TIFF.
Выберите значения непрозрачности изменения для каждого канала микроскопа и отрегулируйте значение альфа-канала для цветовых каналов, присутствующих на изображении, таким образом, чтобы фон был удален и в клетках остаются только флуоресцентные лампы. Чтобы визуализировать эффект, выберите Просмотр 3D rendering'для проверки порога установлены правильно, и если изображение выглядит правильно, сохранить значения непрозрачности в таблице трекер эксперимента. Затем используйте марширующих кубов для преобразования изображения громкости в отдельные 3D треугольные сетчатые объекты, сохраненные в формате данных VTK.
Чтобы соответствовать плоскости к эндотелиальной барьер, сначала найти центроиды клеток. Используйте фильтр подключения полиданных для итерации через список сеток в файле VTK для извлечения областей, которые не подключены. Рассчитайте центроид каждой сетки и добавьте измерение в список центроидов фильтрации для сеток, которые являются слишком большими или слишком маленькими.
Чтобы поместить плоскость в список центроидов для эндотелиальных клеток, используйте минимизацию метода ошибки, запустите Visualize RFP centroids и плоскости fit'для создания и построения плоскости подходят и проверить припадок плоскости, регулируя пригонку вручную по мере необходимости. Когда самолет был должным образом установлен, сохранить нормальный плоскости в файл трекера эксперимента. Чтобы измерить каждый фенотип раковых клеток после характеристики эндотелиального слоя с плоскости, загрузить функцию анализа клеток и запустить Читать в эксперименте трекер информации и анализировать каналы, которые существуют "для итерации более и анализировать каждую область в файле VTK.
Для каждой области функция будет обрезать каждую ячейку так, чтобы сетка ниже мембраны вычисляется. Для измерения клеточного фенотипа вычислите форму, объем и положение каждой раковой клетки. Затем измерьте объем и положение каждой обрезанной раковой клетки, чтобы вычислить процент клеток, которые экстравагантные через эндотелиальный барьер.
После выполнения этих шагов в течение нескольких экспериментов запустите Export данные в качестве единого файла xlsx для сохранения данных в электронной таблице. Микрофлюидный чип BBN с сотким эндотелиальным барьером приемлем для экспериментов, в то время как микрофлюидный чип BBN с особенно плохим эндотелиальным покрытием - нет. В этом репрезентативном анализе мозг ищет линии раковых клеток, экспонаты субпопуляции клеток, которые экстравагантных через эндотелиальный барьер и мигрирует глубоко в пространство ниши мозга микрофлюидных чипов BBN Через два и девять дней после воздействия, родительские раковые клетки поддерживали значительную долю клеток на вершине барьера от пространства ниши мозга , в то время как метастатическая популяция раковых клеток мозга поддерживала долю клеток, которые были более чем на 100% экстравагантными.
Морфологическая количественная оценка формы раковых клеток показала, что родительские клетки продемонстрировали меньше сферически сформированных клеток день один после посева, в то время как после двух и девяти дней взаимодействия обе линии раковых клеток тенденции к снижению их сферичности. Кроме того, субпопуляции раковых клеток, которые экстравагантные в астрической нише были меньше по размеру, по сравнению с раковыми клетками, которые остались во взаимодействии с эндотелиальным барьером без экстравагантности в мозг. Мозг ищет раковых клеток линий и пациента производных ксенотрансплантатов, экспонат фенотипической картины в микрофлюидных чип BBN, которые могут быть использованы для дифференциации между метастатическим мозгом и не метастатических раковых клеток мозга путем машинного обучения.
Самоутвер также важен самовы выбор. Эндотелиальные клетки с более высоким, низким числом проходов проявляли переменное барьерное поведение. Кроме того, раковые клетки и их флуоресцентное выражение могут меняться с течением времени.
После этой процедуры исследователи могут использовать молекулярное профилирование дома или клеток секрета в устройстве для изучения молекулярных механизмов метастазов. Этот метод позволяет изутовить сложные взаимодействия между раковыми клетками и их микроокнимами, сочетая сконструированную микроокниронику с количественной визуализацией нишевых компонентов с течением времени.
