La tomografía confocal fue desarrollada para obtener toda la gama de comportamientos de las células cancerosas, ya que interactúan con la barrera celular y el nicho. Este método proporciona una base para estudiar las metástasis a medida que ocurren. Este enfoque es útil para cuantificar el comportamiento de las células vivas.
La tomografía confocal, cuando se combina con el aprendizaje automático, es útil para una variedad de plataformas de órgano en chip. El análisis de tumores primarios o recurrentes o células tumorales circulantes puede constituir una herramienta de diagnóstico importante para predecir metástasis cerebrales y discernir la metastásica cerebral a partir de células metastásicas no cerebrales. Para montar el dispositivo BBN microfluídico, transfiera un dispositivo desde el desecador de vacío a una superficie adecuada con las entradas hacia abajo y coloque toda la configuración en una cámara de plasma.
Coloque toda la configuración en una cámara de plasma y tire de un vacío antes de tratar el dispositivo con plasma durante 30 segundos a 80 vatios. Al final del tratamiento, utilice una guía para colocar rápidamente el dispositivo, el lado de entrada hacia arriba en el portaobjetos de vidrio en el banco de laboratorio para crear una unión permanente entre los PPM del dispositivo y la diapositiva. A continuación, inserte las puntas de pipeta de 200 microlitros, corte dos milímetros de la punta en todas las entradas y salidas y coloque el dispositivo en la cámara de plasma durante un tratamiento de plasma de ocho minutos y 200 vatios.
Después de que el dispositivo se haya enfriado, coloque el dispositivo en un recipiente secundario estéril y dentro de los 15 minutos posteriores al tratamiento del plásmido, transfiera 120 microlitros de una solución de astrocito de colágeno al dispositivo a través de la punta de la pipeta para la cámara inferior. Permita que la solución se enchaca a través de la cámara en la punta de la pipeta opuesta y llene el siguiente canal del dispositivo. Cuando se hayan llenado los cuatro canales del dispositivo, coloque el chip en la incubadora de cultivo celular durante una hora.
Cuando el colágeno se haya establecido, picotee todas las puntas de la pipeta que alimentan la cámara inferior con el medio de cultivo celular completo adecuado y cubra la cámara superior con un 2% de factor de crecimiento reducido en el matrigel, en medio endotelial completo. Cuando ambas cámaras hayan sido codificadas, coloque el dispositivo en la incubadora durante una hora antes de enjuagar la cámara superior con el medio adecuado. Puntas alternas, ver 30 microlitros de una por 10 a la sexta célula endotelial por mililitro de medio apropiado, a través de las puntas en la cámara superior cada 15 minutos, para un total de cuatro alícuotas de células por punta.
Incubar el dispositivo entre siembras. Cuando todas las células endoteliales hayan sido sembradas, llene todas las puntas con el medio y devuelva el dispositivo a la incubadora de cultivo celular durante 48 horas. Cuando la capa endotelial haya madurado, reemplace el medio en el chip para reponer el medio de cultivo celular y sembrar cada canal de cámara superior con 30 microlitros de uno por 10 a las seis células cancerosas por mililitro de medio apropiado.
Después de que cada 30 microlitsión alícuota de células se haya sembrado, devuelva el dispositivo a la incubadora durante 15 minutos y luego llene todas las puntas con el medio adecuado devolver el dispositivo a la incubadora de cultivo celular durante 24 a 48 horas. Después de que el dispositivo ha sido cultivado y puesto en imagen, para medir el fenotipo de las células cancerosas, abra el software proporcionado y lea la imagen confocal en la memoria. El software guardará cada canal de color de la imagen confocal 3D en un archivo TIFF separado.
Seleccione Cambiar valores de opacidad para cada canal de microscopio' y ajuste el valor alfa del canal para los canales de color presentes en la imagen, de modo que se elimine el fondo y solo permanezcan los fluorescentes dentro de las celdas. Para visualizar el efecto, seleccione Ver una representación 3D' para comprobar que el umbral está establecido correctamente y si la imagen se ve correcta, guarde los valores de opacidad en la hoja de cálculo del rastreador de experimentos. A continuación, utilice cubos de marcha para convertir la imagen de volumen en objetos de malla triangular 3D individuales guardados en el formato de datos VTK.
Para ajustar un plano a la barrera endotelial, primero localice los centroides de la celda. Utilice el filtro de conectividad polydata para recorrer en iteración la lista de mallas del archivo VTK para extraer las regiones que no están conectadas. Calcule el centroide de cada malla y agregue la medida a una lista de centroides que filtran las mallas que son demasiado grandes o demasiado pequeñas.
Para ajustar un plano a la lista de centroides para las celdas endoteliales, utilice una minimización del método de error, ejecute Visualizar centroides RFP y ajuste de plano para generar y trazar el ajuste del plano e inspeccionar el ajuste del plano, ajustando el ajuste manualmente según sea necesario. Cuando el plano se haya ajustado correctamente, guarde la normal del plano en el archivo de seguimiento del experimento. Para medir cada fenotipo de células cancerosas después de caracterizar la capa endotelial con un plano, cargue la función de análisis de celdas y ejecute Leer en la información del rastreador del experimento y analice los canales que existen"para iterar y analizar cada región del archivo VTK.
Para cada región, la función recortará cada celda para que se calcule la malla debajo de la membrana. Para medir el fenotipo celular, calcule la forma, el volumen y la posición de cada célula cancerosa. Luego mida el volumen y la posición de cada célula cancerosa recortada para calcular el porcentaje de célula que se extravastó a través de la barrera endotelial.
Después de realizar estos pasos para varios experimentos, ejecute Exportar los datos como un único archivo xlsx para guardar los datos en una hoja de cálculo. Un chip BBN microfluídico con una barrera endotelial confluente es aceptable para la experimentación, mientras que un chip BBN microfluídico con cobertura endotelial especialmente pobre, no lo es. En este análisis representativo de la línea celular de cáncer que busca el cerebro, exhibe una subpoblación de células que se extravasa a través de la barrera endotelial y migra profundamente en el espacio del nicho cerebral del chip bbN microfluídico A los dos y nueve días después de la exposición, las células cancerosas parentales mantuvieron una proporción sustancial de células en la parte superior de la barrera lejos del espacio de nicho cerebral , mientras que la población de células cancerosas metastásicas cerebrales mantenía una proporción de células que eran mayores del 100% extravasadas.
La cuantificación morfológica de la forma de las células cancerosas indicó que las células parentales demostraron menos células de forma esférica el primer día después de la siembra, mientras que después de dos y nueve días de interacción ambas líneas celulares de cáncer tendencia a disminuir su esfericidad. Además, las subpoblaciones de células cancerosas que se extravasaron en el nicho astricídico eran de menor tamaño, en comparación con las células cancerosas que permanecían en interacción con la barrera endotelial sin extravasar en el cerebro. El cerebro que busca líneas celulares de cáncer y xenoinjertos derivados del paciente, exhiben un patrón fenotípico en el chip microfluídico BBN que podría ser explotado para diferenciar entre las células cancerosas metastásicas cerebrales y no cerebrales mediante el aprendizaje automático.
La autoselección es importante. Las células endoteliales con un número de paso más alto y bajo mostraban comportamientos de barrera variable. Además, las células cancerosas y su expresión fluorescente pueden cambiar con el tiempo.
Después de este procedimiento, los investigadores pueden emplear el perfil molecular de la casa o células del secreto en el dispositivo con el fin de estudiar los mecanismos moleculares de las metástasis. Esta técnica permite explorar interacciones complejas entre las células cancerosas y sus microambientes, combinando un microambiente de ingeniería con una imagen cuantitativa de componentes de nicho a lo largo del tiempo.
