Konfokal tomografi kanser hücresi davranışlarının tam gam elde etmek için geliştirilmiştir, onlar hücresel bariyer ve niş ile etkileşim gibi. Bu yöntem, metastazların oluştuğu gibi incelenmesi için bir temel sağlar. Bu yaklaşım, canlı hücre davranışını ölçmek için yararlıdır.
Konfokal tomografi, makine öğrenimi ile birleştirildiğinde, çeşitli organ-on-a-chip platformlar için yararlıdır. Primer veya tekrarlayan tümör veya dolaşımdaki tümör hücrelerinin analizi, beyin metastazlarını tahmin etmek ve beyin metastatik olmayan hücrelerden beyin metastatiklerini ayırt etmek için önemli bir tanı aracı oluşturabilir. Mikroakışkan BBN cihazını monte etmek için, bir cihazı vakum kurutucudan aşağı bakacak şekilde uygun bir yüzeye aktarın ve tüm kurulumu plazma odasına yerleştirin.
Tüm kurulumu bir plazma odasına yerleştirin ve cihazı 80 Watt'ta 30 saniye boyunca plazmayla tedavi etmeden önce bir vakum çekin. Tedavinin sonunda, cihazın PPM'leri ile slayt arasında kalıcı bir bağ oluşturmak için cihazı, giriş tarafını laboratuvar tezgahındaki cam slayta hızlı bir şekilde yerleştirmek için bir kılavuz kullanın. Daha sonra, 200 mikrolitrelik pipet uçları yerleştirin, uçtan iki milimetreyi tüm giriş ve çıkışlara kesin ve cihazı sekiz dakika, 200 watt plazma tedavisi için plazma odasına yerleştirin.
Cihaz soğuduktan sonra cihazı steril bir ikincil kap içine yerleştirin ve plazmid tedavisinden 15 dakika sonra, 120 mikrolitre kollajen astrosit çözeltisini alt oda için pipet ucu ile cihaza aktarın. Çözeltinin oda boyunca ters pipet ucuna fitil ve cihazın bir sonraki kanalını doldurmasına izin verin. Cihazın dört kanalı da dolduğunda, çipi bir saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
Kollajen ayarlandığında, uygun tam hücre kültürü orta ile alt oda besleme pipet uçları tüm fatura ve tam endotel orta, % 2 büyüme faktörü azaltılmış matrigel ile üst oda kat. Her iki oda da kodlandığında, üst odayı uygun ortamla durulamadan önce cihazı bir saat boyunca kuvöze yerleştirin. Alternatif ipuçları, bir kez 30 mikrolitre bakın 10 uygun orta mililitre başına altıncı endotel hücreleri için, her 15 dakikada bir üst odaya uçları aracılığıyla, uç başına hücrelerin dört aliquots toplam için.
Cihazı tohumlar arasında kuluçkaya yatırın. Tüm endotel hücreleri tohumlanmış zaman, orta ile tüm ipuçlarını doldurun ve 48 saat boyunca hücre kültürü kuluçka cihazı iade edin. Endotel tabakası olgunlaştığında, hücre kültürü ortamını doldurmak için çipteki ortamı değiştirin ve her üst oda kanalını bir kere 10 mikrolitre ile uygun ortam mililitresi başına altı kanser hücresine yerleştirin.
Hücrelerin her 30 mikrolitre aliquot tohumlanmış sonra, 15 dakika boyunca kuvöz için cihaz iade ve uygun ortam ile tüm ipuçlarını doldurun 24 ila 48 saat boyunca hücre kültürü kuluçka cihazı döndürün. Cihaz kültürlendikten ve görüntülendikten sonra, kanser hücrelerinin fenotipini ölçmek için, sağlanan yazılımı açın ve konfokal görüntüyü belleğe okuyun. Yazılım ayrı bir TIFF dosyasına 3B konfokal görüntü her renk kanalı kaydeder.
Her mikroskop kanalı için opaklık değerlerini değiştir'i seçin ve görüntüde bulunan renk kanallarının kanal alfa değerini, arka planın kaldırılmasını ve yalnızca hücrelerin içindeki floresanların kaldığını ayarlayın. Efekti görselleştirmek için, eşdağın doğru ayarlıolduğunu doğrulamak için 3B render'ı görüntüle'yi seçin ve görüntü doğru görünüyorsa, deneme izleyicisi elektronik tablosundaki donukluk değerlerini kaydedin. Ardından, birim görüntüyü VTK veri biçiminde kaydedilen tek tek 3B üçgen üçgen eşlenmiş nesnelere dönüştürmek için yürüyen küpler kullanın.
Bir uçağı endotel bariyerine sığdırmak için önce hücre merkezlerini bulun. Bağlı olmayan bölgeleri ayıklamak için VTK dosyasındaki kısalıklar listesinde gezinmek için çoklu veri bağlantısı filtresini kullanın. Her kafesin santrilojiyi hesaplayın ve ölçüyü çok büyük veya çok küçük kafesler için filtreleme yapan centroidler listesine ekleyin.
Bir uçağı endotel hücreleri için merkezler listesine sığdırmak için, hata yönteminin en aza indirgemesini kullanın, RFP santrifüjlerini ve düzlem fit'i kullanarak uçağın sığmasını oluşturmak ve çizmek için uygun uyumu ayarlayın ve uygun uyumu el ile ayarlayın. Uçak düzgün bir şekilde takıldığında, normal düzlemi deneme izleyici dosyasına kaydedin. Bir düzlem ile endotel tabakası karakterize sonra her kanser hücresi fenotip ölçmek için, hücre analizi işlevini yüklemek ve deneme izci bilgi Read çalıştırmak ve üzerinde yinelemek ve VTK dosyasında her bölgeyi analiz etmek için var olan kanalları analiz.
Her bölge için işlev, membranın altındaki kafesin hesaplanacak şekilde her hücreyi keser. Hücresel fenotip ölçmek için, şekil, hacim ve her kanser hücresinin konumunu hesaplamak. Sonra endotel bariyeri ile ekstravaze hücre yüzdesini hesaplamak için her kırpılmış kanser hücresinin hacmi ve konumunu ölçmek.
Birkaç deneme için bu adımları yaptıktan sonra verileri tek bir xlsx dosyası olarak dışa aktar'ı çalıştırın verileri elektronik tabloya kaydedin. Bir konfluent endotel bariyeri ile bir mikroakışkan BBN çip deney için kabul edilebilir, özellikle kötü endotel kapsama ile bir mikroakışkan BBN çip, değildir. Bu temsili analizde kanser hücre hattı arayan beyin, endotel bariyeri boyunca ekstravaze ve maruz kaldıktan sonra iki ve dokuz gün mikroakışkan BBN çipin beyin niş uzayına derin göç hücrelerinin bir alt popülasyon sergiler, ebeveyn kanser hücreleri uzak beyin niş uzaydan bariyerin üstünde hücrelerin önemli bir kısmını korudu , Beyin metastatik kanser hücresi popülasyonu% 100 extravasated daha büyük olan hücrelerin bir kısmını muhafaza ederken.
Kanser hücresi şeklinin morfolojik niceliği, ebeveyn hücrelerinin tohumlama sonrası iki ve dokuz günlük etkileşimden sonra her iki kanser hücresi hattının da her iki kanser hücresi çizgisinin de her iki hücre çizgisinin de kendi tesperikliğini azaltmaya doğru eğilimgösterdiğini göstermiştir. Buna ek olarak, astrikülen niş içine ekstravaze kanser hücresi alt popülasyonları boyutu daha küçüktü, beyin içine ekstravazlama olmadan endotel bariyeri ile etkileşim içinde kalan kanser hücreleri ile karşılaştırıldığında. Beyin arayan kanser hücre hatları ve hasta türetilen ksenogreftler, makine öğrenme ile beyin metastatik ve beyin dışı metastatik kanser hücreleri arasında ayrım yapmak için istismar edilebilir mikroakışkan BBN çip bir fenotipik desen sergilemek.
Kendi kendini seçme önemlidir. Daha yüksek, düşük geçiş sayısına sahip endotel hücreleri değişken bariyer davranışları sergiledi. Buna ek olarak, kanser hücreleri ve floresan ifade zaman içinde değişebilir.
Bu işlemden sonra araştırmacılar metastazların moleküler mekanizmalarını incelemek için sırrın ev veya hücrelerinin moleküler profilini çıkartabilirler. Bu teknik, zaman içinde niş bileşenlerin nicel bir görüntüleme ile tasarlanmış bir mikro çevre birleştirerek, kanser hücreleri ve mikro ortamları arasındaki karmaşık etkileşimlerin araştırılmasını sağlar.
