공초점 단층 촬영은 세포 장벽 및 틈새 시장과 상호 작용하기 때문에 암 세포 행동의 전체 영역을 얻기 위해 개발되었습니다. 이 방법은 전이가 발생할 때 전이를 연구하기위한 기초를 제공합니다. 이 방법은 라이브 셀 동작을 정량화하는 데 유용합니다.
공초점 단층 촬영은 기계 학습과 결합될 때 다양한 장기 온 칩 플랫폼에 유용합니다. 1 차 또는 재발종양 또는 순환 종양 세포를 분석하는 것은 두뇌 전이를 예측하고 비 두뇌 전이성 세포에서 두뇌 전이성을 분별하는 중요한 진단 공구를 구성할 수 있습니다. 미세 유체 BBN 장치를 조립하려면 진공 건조기에서 장치를 입구가 아래로 향하고 전체 설정을 플라즈마 챔버로 배치하여 적절한 표면으로 이송합니다.
전체 설정을 플라즈마 챔버에 넣고 진공을 당기고 80 와트에서 30 초 동안 플라즈마로 장치를 처리하십시오. 치료가 끝나면 가이드를 사용하여 장치를 신속하게 배치하고 실험실 벤치의 유리 슬라이드에 입구 측면을 올려 놓고 장치의 PDM과 슬라이드 사이의 영구적 인 결합을 만듭니다. 다음으로, 200 마이크로리터 파이펫 팁을 삽입하고, 팁에서 2밀리미터를 모든 입구와 콘센트에 잘라서 장치를 플라즈마 챔버에 8분, 200와트 플라즈마 처리를 배치합니다.
장치가 냉각된 후 장치를 멸균 보조 용기에 넣고 플라스미드 처리 후 15분 이내에 콜라겐 성상세포 용액 120마이크로리터를 하단 챔버의 파이펫 팁을 통해 장치에 옮기십시오. 용액이 챔버를 가로질러 반대 쪽 파이펫 팁으로 심을 수 있도록 하고 장치의 다음 채널을 채웁니다. 장치의 네 개의 채널이 모두 채워지면 칩을 세포 배양 인큐베이터에 1시간 동안 배치합니다.
콜라겐이 설정되면, 적절한 완전한 세포 배양 배지로 바닥 챔버를 공급하는 모든 파이펫 팁을 빌링하고 완전한 내피 배지에서 2 % 성장 인자 감소 된 matrigel로 상부 챔버를 코팅합니다. 두 챔버가 코딩된 경우, 적절한 매체로 상부 챔버를 헹도하기 전에 장치를 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다. 교대 팁은, 팁 당 세포의 총 4 개의 알리쿼트에 대한 15 분마다 상부 챔버로 팁을 통해, 적절한 매체의 밀리리터 당 10 ~ 여섯 번째 내피 세포 당 10 의 30 마이크로 리터를 참조하십시오.
시드 사이에 장치를 배양합니다. 모든 내피 세포가 시드되면 모든 팁을 배지로 채우고 장치를 세포 배양 인큐베이터로 48시간 동안 반환한다. 내피층이 성숙되면, 칩내 배지를 교체하여 각 상부 챔버 채널을 30 마이크로리터로 10~6개의 암세포로 적절한 배지의 밀리리터당 10마이크로리터로 보충한다.
세포의 각 30 마이크로리터 알리쿼트가 시드된 후, 15분 동안 인큐베이터로 장치를 반납한 다음, 24~48시간 동안 세포 배양 배양에 장치를 반환하는 적절한 배지로 모든 팁을 채운다. 장치가 배양 및 이미지된 후, 암세포의 표현형을 측정하고, 제공된 소프트웨어를 열고, 공초점 이미지를 메모리로 읽습니다. 이 소프트웨어는 별도의 TIFF 파일에 3D 공초점 이미지에서 각 색상 채널을 저장합니다.
각 현미경 채널에 대한 불투명도 변경 값을 선택하고 배경이 제거되고 셀 내의 형광만 남아 있도록 이미지에 있는 색상 채널의 채널 알파 값을 조정합니다. 효과를 시각화하려면 3D 렌더링 보기를 선택하여 임계값이 올바르게 설정되어 있는지 확인하고 이미지가 올바른 것처럼 보이는 경우 실험 추적기 스프레드시트에 불투명도 값을 저장합니다. 그런 다음 행진 큐브를 사용하여 볼륨 이미지를 VTK 데이터 형식에 저장된 개별 3D 삼각형 메시 개체로 변환합니다.
내피 장벽에 비행기에 맞게 먼저 셀 중심을 찾습니다. 폴리데이터 연결 필터를 사용하여 VTK 파일의 메쉬 목록을 반복하여 연결되지 않은 영역을 추출합니다. 각 메시의 중심을 계산하고 너무 크거나 너무 작은 메시에 대한 센트로이드 필터링 목록에 측정값을 추가합니다.
내피 셀의 중심 구조 목록에 평면에 맞게하려면 오류 메서드를 최소화하고 RFP 중심 및 평면 적합성 시각화를 실행하여 비행기에 맞게 생성 및 플롯및 평면의 적합성을 검사하여 필요에 따라 수동으로 착용감을 조정합니다. 평면이 제대로 장착된 경우 평면의 정상을 실험 추적기 파일에 저장합니다. 평면으로 내피층을 특성화한 후 각 암세포 표현형을 측정하기 위해, 셀 분석 기능을 로드하고 실험 추적기 정보에서 읽기를 실행하고 존재하는 채널을 분석한다"고 VTK 파일의 각 영역을 반복하고 분석한다.
각 영역에 대해 함수는 멤브레인 아래의 메시가 계산되도록 각 셀을 잘라냅니다. 세포 표현형을 측정하려면 각 암세포의 모양, 부피 및 위치를 계산합니다. 그런 다음 각 잘린 암 세포의 부피 와 위치를 측정하여 내피 장벽을 통해 사치스러운 세포의 비율을 계산합니다.
여러 실험에 대한 이러한 단계를 수행한 후 데이터를 스프레드시트에 저장하기 위해 데이터를 단일 xlsx 파일로 내보내도록 실행합니다. 컨플루언스 내피 장벽이 있는 미세유체 BBN 칩은 실험에 허용되며, 특히 내피 커버리지가 열악한 미세유체 BBN 칩은 그렇지 않습니다. 이 대표적인 분석에서 암 세포주를 찾는 뇌는 내피 장벽을 가로 질러 사치화하고 노출 후 2 9 일 동안 미세 유체 BBN 칩의 뇌 틈새 공간으로 깊숙이 이동하는 세포의 하위 집단을 나타내며, 부모의 암세포는 뇌 틈새 공간에서 장벽 위에 상당한 비율을 유지했습니다. , 뇌 전이성 암 세포 인구는 100 % 이상 사치된 세포의 비율을 유지했습니다.
암 세포 모양의 형태학적 정량화는 부모 세포가 1일 후 시드후 구형 세포가 적다는 것을 보여주었으며, 2일과 9일 간의 상호 작용 후 두 암 세포주가 구형체를 감소시키는 쪽으로 경향을 보였다. 또한, 혈관 틈새 시장으로 사치화암 세포 하위 인구는 뇌로 사치화하지 않고 내피 장벽과의 상호 작용에 남아 있는 암세포에 비해 크기가 작았다. 암 세포주 및 환자 유래 이종이식을 찾는 뇌는 기계 학습에 의한 뇌 전이성 및 비뇌 전이성 암세포를 구별하기 위해 악용될 수 있는 미세유체 BBN 칩에 표면 패턴을 나타낸다.
자기 선택이 중요합니다. 더 높고 낮은 통로 수를 가진 내피 세포는 가변 장벽 행동을 나타냈다. 또한, 암세포와 그들의 형광발현은 시간이 지남에 따라 변할 수 있다.
이 절차 후에, 연구원은 전이의 분자 기계장치를 공부하기 위하여 장치에 있는 비밀의 가정 또는 세포의 분자 프로파일링을 채택할 수 있습니다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 틈새 구성 요소의 정량적 이미징과 엔지니어링 된 마이크로 환경을 결합하여 암세포와 그 마이크로 환경 사이의 복잡한 상호 작용을 탐구 할 수 있습니다.
