A tomografia confocal foi desenvolvida para obter toda a gama de comportamentos de células cancerosas, pois interagem com a barreira celular e o nicho. Este método fornece uma base para estudar metástases à medida que ocorrem. Esta abordagem é útil para quantificar o comportamento das células vivas.
A tomografia confocal, quando combinada com aprendizado de máquina, é útil para uma variedade de plataformas organ-on-a-chip. Analisar tumores primários ou recorrentes ou células tumorais circulantes pode constituir uma importante ferramenta de diagnóstico para prever metástases cerebrais e discernir metastáticos cerebrais de células metastáticas não cerebrais. Para montar o dispositivo BBN microfluidic, transfira um dispositivo do desiccador de vácuo para uma superfície apropriada com as entradas viradas para baixo e coloque toda a configuração em uma câmara de plasma.
Coloque toda a configuração em uma câmara de plasma e puxe um vácuo antes de tratar o dispositivo com plasma por 30 segundos a 80 Watts. No final do tratamento, use um guia para colocar rapidamente o dispositivo, o lado da entrada sobre o escorregador de vidro no banco do laboratório para criar uma ligação permanente entre os PDMs do dispositivo e o slide. Em seguida, insira 200 pontas de pipeta de microliter, corte dois milímetros da ponta em todas as entradas e tomadas e coloque o dispositivo na câmara de plasma para um tratamento de plasma de oito minutos e 200 watts.
Depois que o dispositivo tiver esfriado, coloque o dispositivo em um recipiente secundário estéril e dentro de 15 minutos de tratamento plasmídeo, transfira 120 microliters de uma solução de astrócito de colágeno para o dispositivo através da ponta da pipeta para a câmara inferior. Deixe a solução atravessar a câmara na ponta oposta da pipeta e preencha o próximo canal do dispositivo. Quando todos os quatro canais do dispositivo tiverem sido preenchidos, coloque o chip na incubadora de cultura celular por uma hora.
Quando o colágeno estiver definido, cubra todas as pontas de pipeta alimentando a câmara inferior com o meio de cultura celular completa apropriada e cubra a câmara superior com fator de crescimento reduzido de 2%, em meio endotelial completo. Quando ambas as câmaras tiverem sido codificadas, coloque o dispositivo na incubadora por uma hora antes de enxaguar a câmara superior com o meio apropriado. Dicas alternadas, veja 30 microliters de uma vez 10 a sexta células endoteliais por mililitro de meio apropriado, através das pontas na câmara superior a cada 15 minutos, para um total de quatro alíquotas de células por ponta.
Incubar o dispositivo entre as sementes. Quando todas as células endoteliais tiverem sido semeadas, preencha todas as pontas com o meio e devolva o dispositivo à incubadora de cultura celular por 48 horas. Quando a camada endotelial amadurecer, substitua o meio no chip para repor o meio de cultura celular e sementes de cada canal de câmara superior com 30 microliters de uma vez 10 para as seis células cancerígenas por mililitro de meio apropriado.
Após cada 30 microliter aliquot de células ter sido semeado, devolva o dispositivo à incubadora por 15 minutos e, em seguida, preencha todas as dicas com o meio apropriado retornar o dispositivo à incubadora de cultura celular por 24 a 48 horas. Depois que o dispositivo for cultivado e imageado, para medir o fenótipo das células cancerosas, abra o software fornecido e leia a imagem confocal na memória. O software salvará cada canal de cores da imagem confocal 3D em um arquivo TIFF separado.
Selecione Alterar os valores de opacidade para cada canal de microscópio e ajustar o valor alfa do canal para os canais de cores presentes na imagem, de modo que o fundo seja removido e apenas os fluorescentes dentro das células permaneçam. Para visualizar o efeito, selecione Exibir uma renderização 3D'para verificar se o limiar está definido corretamente e se a imagem parecer correta, salve os valores de opacidade na planilha do rastreador de experimentos. Em seguida, use cubos marchando para converter a imagem de volume em objetos triangulares triangulares individuais salvos no formato de dados VTK.
Para encaixar um avião na barreira endotelial, primeiro localize os centrosids celulares. Use o filtro de conectividade de polidados para iterar através da lista de malhas no arquivo VTK para extrair as regiões que não estão conectadas. Calcule o centroid de cada malha e adicione a medida a uma lista de centrosids filtrando para malhas muito grandes ou muito pequenas.
Para encaixar um plano na lista de centroides para as células endoteliais, use uma minimização do método de erro, execute os centrosids de RFP visualize e ajuste de plano para gerar e traçar o ajuste do plano e inspecionar o ajuste do plano, ajustando o ajuste manualmente conforme necessário. Quando o avião estiver devidamente instalado, salve o normal do avião para o arquivo do rastreador de experimentos. Para medir cada fenótipo de células cancerosas depois de caracterizar a camada endotelial com um plano, carregue a função de análise celular e execute Leia nas informações do rastreador de experimentos e analise os canais existentes "para iterar e analisar cada região no arquivo VTK.
Para cada região, a função irá cortar cada célula para que a malha abaixo da membrana seja calculada. Para medir o fenótipo celular, calcule a forma, o volume e a posição de cada célula cancerosa. Em seguida, meça o volume e a posição de cada célula cancerígena cortada para calcular a porcentagem de células que extravasas através da barreira endotelial.
Depois de executar essas etapas para vários experimentos, execute Export the data como um único arquivo xlsx para salvar os dados em uma planilha. Um chip BBN microfluido com uma barreira endotelial confluente é aceitável para experimentação, enquanto um chip BBN microfluidic com cobertura endotelial especialmente ruim, não é. Nesta análise representativa, o cérebro que busca a linha celular cancerígena, exibe uma subpopulação de células que extravasam através da barreira endotelial e migram profundamente para o espaço de nicho cerebral do chip BBN microfluidic Aos dois e nove dias após a exposição, as células cancerígenas dos pais mantiveram uma proporção substancial de células em cima da barreira longe do espaço do nicho cerebral , enquanto a população de células cancerígenas metastáticas do cérebro manteve uma proporção de células que eram maiores que 100% extravasadas.
A quantificação morfológica da forma celular cancerígena indicou que as células parentais demonstraram menos células esfericamente moldadas no primeiro dia após a semeadura, enquanto após dois e nove dias de interação ambas as linhas celulares cancerígenas tendem a diminuir sua esfericidade. Além disso, as subpopulações de células cancerígenas que extravasam no nicho astricídico eram menores em tamanho, em comparação com as células cancerígenas que permaneceram em interação com a barreira endotelial sem extravasar no cérebro. Cérebro que busca linhas de células cancerígenas e xenoenxertos derivados do paciente, exibem um padrão fenotípico no chip BBN microfluido que poderia ser explorado para diferenciar entre as células cancerígenas metastáticas cerebrais e não cerebrais por aprendizado de máquina.
A auto-seleção é importante. As células endoteliais com maior número de passagem apresentaram comportamentos de barreira variável. Além disso, as células cancerígenas e sua expressão fluorescente podem mudar com o tempo.
Após esse procedimento, os pesquisadores podem empregar perfis moleculares da casa ou células do segredo no dispositivo, a fim de estudar mecanismos moleculares de metástases. Essa técnica permite a exploração de interações complexas entre células cancerígenas e seus microambientes, combinando um microambiente projetado com uma imagem quantitativa de componentes de nicho ao longo do tempo.
