Эксперименты с ломтиками мозга позволяют допроса нейронной функции с высоким электрическим и временным разрешением, но эти ломтики обычно разорвать многие пресинаптические соединения. Клиновидный ломтик поддерживает более нетронутую пресинаптическую схему. Этот модифицированный срез мозга поддерживает более полную виво-подобную нейронную схему, обеспечивая при этом преимущества экспериментов in vitro, такие как визуально управляемые записи зажима патчей, фармакология и визуализация активности.
Точную нарезанную геометрию клина можно оценить на основе расположения атласа нейронов в цепи, но целостность пресинаптической шематы и аксонов должна определяться с помощью гистологии. Начните с помощью лезвия бритвы, чтобы сократить кожу в средней линии черепа от носа до задней части шеи. Очистите кожу, чтобы разоблачить череп и, начиная с основания черепа и продолжая к носу, использовать небольшие ножницы, чтобы сделать разрез в черепе через середину.
На шве лямбды, сделать порезы в черепе от средней линии боковой к уху с обеих сторон, чтобы очистить череп, чтобы разоблачить мозг. Начиная с рострального конца, используйте небольшой лабораторный шпатель, чтобы аккуратно поднять мозг из черепа, чтобы зрительные нервы были разорваны. Продолжайте мягко работать мозга назад, подвергая брюшной поверхности и использовать тонкие щипся, чтобы тщательно ущипнуть тригеминальных нервов вблизи брюшной поверхности ствола мозга, чтобы сократить их.
Поместите препарат в стеклянную чашку Петри, наполненную холодным нарезаным раствором, и поместите блюдо под рассеченный микроскоп. Обрезать лицевые нервы близко к стволу мозга, чтобы разоблачить вестибюльно-скелетные нервы. Используйте тонкие типсы, чтобы подтолкнуть кончики в foramina, где вестибюльно-бликохлеарный нерв выходит из черепа, насколько это возможно.
Pinch разорвать нервы с обеих сторон, оставляя нервный корень прилагается к стволу мозга. Удалите озночек и сосудов из брюшной поверхности ствола мозга вблизи трапециевидного тела. Затем щепотку оставшихся черепных нервов и соединительной ткани, чтобы полностью освободить мозг от черепа, заботясь, чтобы сохранить оставшийся спинной мозг, если это возможно.
Для подготовки поверхности мозга для приспособления к сцене место брюшной стороны мозга вверх и использовать тупой инструмент, чтобы мягко обездвижить спинной мозг для стабилизации ткани мозга. Вставьте открытые типсы под углом около 20 градусов через мозг в нижней части блюда, так что кончики выхода спинной поверхности мозга caudal к оптической чиазм и использовать лезвие бритвы, чтобы сократить вдоль типсов. Затем подготовь один кубический сантиметровый блок 4%agar и выложить небольшую каплю клея в прямоугольник на сцене.
Используйте типсы, чтобы осторожно поднять мозг и аккуратно мазок избыток жидкости с краем бумажного полотенца. Затем поместите заблокированную поверхность на клей так, чтобы вентраальная поверхность была обращена к направлению лезвия во время нарезки и осторожно прижмите агаровый блок к спинной поверхности в качестве опоры. Чтобы приобрести ломтики клина с корнем кохлеарного нерва на толстой стороне и медиальной оливокохлеарных нейронов и медиальное ядро трапециевидного тела на тонкой стороне, поместите магнитный диск с прикрепленным мозгом на держатель сцены и поместите держателя в нарезке камеры вибромы с вентральной поверхности мозга, ориентированной на лезвие.
Заполните камеру раствором ледяной нарезки и опустите лезвие в карбогенный раствор. Вырезать ломтики caudal в области, представляющие интерес, чтобы убедиться, что ломтики симметричны. Затем сдвинуть сцену примерно на 15 градусов в одну сторону.
Продолжить нарезки тщательно, пока корень слухового нерва близко к поверхности с одной стороны, и лицевой нерв можно увидеть на поверхности другой стороны ломтика. Сдвиг этапе 15 градусов обратно в исходное положение и переместить лезвие от ткани. Спин стадии базы 90 градусов, так что боковой край тонкой стороны сталкивается с лезвием и опустите лезвие несколько сотен микрон, прежде чем медленно чего лезвие близко к краю ткани.
С лезвием вытягивается немного ниже лезвие до желаемой толщины тонкого края ломтика. Перемести лезвие назад от ткани и закрути основание этапа назад так, что вентральная поверхность смотрит на основание этапа. Сделайте разрез, чтобы обозначить ростральной поверхности клина ломтик и передать ломтик на один квадратный сантиметр кусок интерфейса бумаги caudle поверхности вниз.
Лицевой нерв должен быть виден на обоих полушариях ломтика на ростральной поверхности. Затем переместите ломтик в инкубационую камеру по 35 градусов по Цельсию, чтобы восстановиться в течение 30 минут. Чтобы настроить срез клина для электрофизиологического анализа поместите образец в камеру записи, которая непрерывно проливается с 35 градусов по Цельсию ACSF и стабилизировать ломтик.
Используя оптику DIC, сосредоточьтесь на корень слухового нерва на толстой стороне ломтика и используйте микроманипулятор для перемещения биполярного вольфрама, стимулирующего электрод к корню слухового нерва и осторожно в поверхность ткани. Переместите поле зрения на брюшное ядро трапециевидного тела на тонкой стороне и выберите медиальный оливокохлеарный нейрон в качестве мишени для электрофизиологии зажима при эпифлюоресценции с помощью фильтра выбросов 561 нанометров. Заполните запись пипетки с соответствующим внутренним решением для предлагаемого эксперимента и под DIC оптики патч и запись из медиальной оливокохлеарный нейрон в конфигурации всей клетки.
Отрегулируйте амплитуду электрической стимуляции корня слухового нерва, чтобы получить последовательные постсинаптические события в медиальной оливокохлеарный нейрон. Затем запустите соответствующие протоколы стимуляции для наблюдения вызванных синаптических тока в медиальной оливокохлеарных нейронов. Этот клин ломтик подготовки предназначен для сдерживания корня слухового нерва и кохлеарного ядра контралатеральной медиальной оливокохлеарных нейронов, предназначенных для записи.
В этом cresyl фиолетовый окрашенных resectioned клин ломтик кохлеарного ядра присутствует почти в полном рострал-caudal степени. И слуховой нервный корень наблюдается вход в кохлеарное ядро. Кроме того, срез клина содержит нейроны медиального ядра трапециевидного тела ipsilateral к медиальной оливокохлеарных нейронов, из которых выполняются записи.
Для подтверждения нейронной связи в клин ломтик пресинаптических входов стимулируются двумя способами. Во-первых, брюшной акустической стрии в средней линии электрически стимулируется, активации T-stellate аксонов непосредственно и медиальное ядро трапециевидных нейронов тела через шаровые густые клетки аксон стимуляции и в результате postsynaptic токов, которые измеряются в медиальной оливокохлеарный нейрон. Корень слухового нерва затем стимулируется, чтобы активировать весь монауральный восходящей схемы ствола мозга и вызвать постсинаптические реакции.
Сравнение показателей задержки начала первого постсинаптического тока, вызванного прямой стимуляцией брюшной акустической стрии с показателями, вызванными слуховой стимуляцией нерва, показывает значительно более длинную задержку в случае стимуляции слухового нерва, что свидетельствует о синаптической задержке в результате дополнительного кохлеарного ядра, активированного во время слуховой стимуляции нерва. Использование анатомических ориентиров и тщательное маневрирование магнитного диска этапе имеют решающее значение для создания клина ломтики с нетронутыми нейрональной схемы и надежной вызвал пост синаптических реакций. Этот метод нарезки обеспечивает платформу для использования дополнительных электрофизиологических инструментов in vitro, включая визуализацию кальция или напряжения, оптогенетику, нейромедиатор, а также внутриклеточную и внеклеточную фармакологию.
