Los experimentos de sectores cerebrales permiten el interrogamiento de la función neuronal con alta resolución eléctrica y temporal, pero estas rebanadas suelen cortar muchas conexiones presinápticas. Una rebanada en forma de cuña mantiene un circuito presináptico más intacto. Esta rebanada cerebral modificada mantiene un circuito neuronal in vivo más completo al tiempo que proporciona los beneficios de la experimentación in vitro, como grabaciones de abrazaderas de parches guiadas visualmente, farmacología e imágenes de actividad.
La geometría precisa en rodajas de cuña se puede estimar en función de las ubicaciones del atlas de las neuronas dentro del circuito, pero la integridad de la schemata presináptica y los axones debe determinarse utilizando histología. Comienza usando una cuchilla de afeitar para cortar la piel en la línea media del cráneo desde la nariz hasta la parte posterior del cuello. Pelar hacia atrás la piel para exponer el cráneo y comenzando en la base del cráneo y continuando hacia la nariz, utilizar tijeras pequeñas para hacer una incisión en el cráneo a través de la línea media.
En la sutura lambda, haz cortes en el cráneo desde la línea media lateralmente hacia la oreja en ambos lados para pelar el cráneo para exponer el cerebro. Comenzando en el extremo rostral, usa una pequeña espátula de laboratorio para levantar suavemente el cerebro del cráneo para permitir que los nervios ópticos se se teguen. Continúe trabajando suavemente el cerebro hacia atrás, exponiendo la superficie ventral y use fórceps finos para pellizcar cuidadosamente los nervios trigéminos cerca de la superficie ventral del tronco encefálica para cortarlos.
Coloque la preparación en un plato petri de vidrio lleno de solución de corte en frío y coloque el plato debajo de un microscopio diseccionado. Recorta los nervios faciales cerca del tronco encefálica para exponer los nervios vestibulocochlear. Usa fórceps finos para empujar las puntas hacia el foramina donde el nervio vestibulocochlear sale del cráneo lo más lejos posible.
Pincha para cortar los nervios de ambos lados, dejando la raíz nerviosa unida al tronco encefálica. Retire las meninges y vasculaturas de la superficie ventral del tronco encefárico cerca del cuerpo trapezoidal. Luego pellizca los nervios craneales restantes y el tejido conectivo para liberar el cerebro completamente del cráneo, teniendo cuidado de preservar la médula espinal restante, si es posible.
Para preparar la superficie del cerebro para fijarse a la etapa, coloque el lado ventral del cerebro hacia arriba y utilice una herramienta contundente para inmovilizar suavemente la médula espinal para estabilizar el tejido cerebral. Inserte fórceps abiertos en un ángulo de aproximadamente 20 grados a través del cerebro hasta la parte inferior de la placa para que las puntas salgan de la superficie dorsal del cerebro caudal al quiasmo óptico y utilice una cuchilla de afeitar para cortar a lo largo de los fórceps. A continuación, prepara un bloque de un centímetro cúbico de 4% de agar y extiende una pequeña gota de pegamento en un rectángulo en el escenario.
Use fórceps para levantar cuidadosamente el cerebro y frote suavemente el exceso de líquido con el borde de una toalla de papel. A continuación, coloque la superficie bloqueada sobre el pegamento para que la superficie ventral esté orientada hacia la dirección de la hoja durante el corte y empuje el bloque de agar suavemente contra la superficie dorsal como soporte. Para adquirir rodajas de cuña con la raíz nerviosa coclear en el lado grueso y las neuronas olivocochlear mediales y el núcleo medial del cuerpo trapezoidal en el lado delgado, coloque el disco magnético con el cerebro unido en el soporte del escenario y coloque el soporte en la cámara de corte de un vibratome con la superficie ventral del cerebro orientada hacia la hoja.
Llene la cámara con una solución de corte en frío y baje la cuchilla en la solución de carbógeno burbuja. Corte los sectores caudal a la región de interés para asegurarse de que los sectores son simétricos. A continuación, cambie la etapa aproximadamente 15 grados a un lado.
Continúe cortando cuidadosamente hasta que la raíz del nervio auditivo esté cerca de la superficie en un lado y el nervio facial se pueda ver en la superficie del otro lado de la rebanada. Vuelva a colocar la etapa 15 grados a la posición original y aleje la hoja del tejido. Gire la base de la etapa 90 grados de modo que el borde lateral del lado delgado esté mirando hacia la hoja y baje la hoja varios cientos de micras antes de llevar lentamente la hoja al borde del tejido.
Con la hoja retraída ligeramente baje la hoja al espesor deseado del borde delgado de la rebanada. Mueva la hoja hacia atrás del tejido y gire la base de la etapa hacia atrás para que la superficie ventral se dirija a la base de la etapa. Haga un corte para designar la superficie rostral de la rebanada de cuña y transfiera la rebanada a un pedazo de un centímetro cuadrado de superficie de caudle de papel de interfaz hacia abajo.
El nervio facial debe ser visible en ambos hemisferios de la rebanada en la superficie rostral. A continuación, mueva la rebanada a una cámara de incubación de 35 grados Celsius para recuperarse durante 30 minutos. Para configurar la rebanada de cuña para el análisis de electrofisiología, coloque la muestra en una cámara de grabación que se perfunda continuamente con 35 grados Celsius ACSF y estabilice la rebanada.
Usando la óptica DIC, concéntrese en la raíz nerviosa auditiva en el lado grueso de la rebanada y use un micromaniprógrafo para mover el electrodo estimulante de tungsteno bipolar a la raíz del nervio auditivo y suavemente en la superficie del tejido. Mueva el campo de visión al núcleo ventral del cuerpo trapezoidal en el lado delgado y seleccione una neurona olivocochlear medial como objetivo para la electrofisiología de la abrazadera de parche bajo epifluorescencia utilizando un filtro de emisión de 561 nanómetros. Llene una pipeta de grabación con la solución interna adecuada para el experimento propuesto y bajo parche óptico DIC y grabe desde la neurona olivocochlear medial en la configuración de toda la célula.
Ajuste la amplitud de estimulación eléctrica de la raíz nerviosa auditiva para obtener eventos postsinápticos consistentes en la neurona olivocochlear medial. A continuación, ejecute los protocolos de estimulación adecuados para observar las corrientes sinápticas evocadas en las neuronas olivocochlear mediales. Esta preparación de la rebanada de cuña está diseñada para contener la raíz nerviosa auditiva y el núcleo coclear contralateral a las neuronas olivocochlear mediales dirigidas a grabaciones.
En esta rebanada de cuña teñida de color violeta cresil, el núcleo coclear está presente en casi su extensión rostral-caudal completa. Y la raíz del nervio auditivo se observa entrando en el núcleo coclear. Además, la rebanada de cuña contiene neuronas del núcleo medial del cuerpo trapezoidal ipsilateral a las neuronas olivocochlear mediales desde las que se realizan grabaciones.
Para confirmar la conectividad neuronal dentro de una rebanada de cuña, las entradas presinápticas se estimulan de dos maneras. En primer lugar, la estría acústica ventral en la línea media se estimula eléctricamente, activando los axones T-estelares directamente y el núcleo medial de las neuronas trapezoidales del cuerpo a través de la estimulación globular de axilas de células tupidas y dando lugar a corrientes postsinápticas que se miden en la neurona olivocochlear medial. La raíz nerviosa auditiva se estimula entonces para activar todo el circuito de tronco cerebral ascendente monaural y para evocar respuestas postsinápticas.
La comparación de las medidas de latencia de inicio de la primera corriente postsináptica evocada con estimulación directa de la estrías acústica ventral con las evocadas con estimulación del nervio auditivo revela una latencia significativamente más larga en el evento de estimulación nerviosa auditiva, indicativo del retraso sináptico resultante de la sinapsis coclear adicional activada durante la estimulación del nervio auditivo. El uso de puntos de referencia anatómicos y la maniobra cuidadosa de la etapa del disco magnético son críticos para crear rodajas de cuña con circuitos neuronales intactos y respuestas sinápticas evocadas confiables. Esta técnica de corte proporciona una plataforma para el uso de herramientas electrofisiología in vitro adicionales, incluyendo imágenes de calcio o voltaje, optogenética, descapado de neurotransmisores y farmacología intracelular y extracelular.
