Gli esperimenti sulle fette cerebrali consentono l'interrogatorio della funzione neuronale con un'alta risoluzione elettrica e temporale, ma queste fette in genere tagliano molte connessioni presnaptiche. Una fetta a forma di cuneo mantiene un circuito presettico più intatto. Questa fetta cerebrale modificata mantiene un circuito neuronale in vivo più completo, fornendo al contempo i benefici della sperimentazione in vitro, come registrazioni di patch clamp guidate visivamente, farmacologia e imaging di attività.
La geometria a cuneo accurata può essere stimata in base alle posizioni dell'atlante dei neuroni all'interno del circuito, ma l'integrità degli schemi e degli assoni presnaptici dovrebbe essere determinata usando l'istologia. Inizia usando una lama di rasoio per tagliare la pelle alla linea mediana del cranio dal naso alla parte posteriore del collo. Sbucciare la pelle per esporre il cranio e partendo dalla base del cranio e continuando verso il naso, utilizzare piccole forbici per fare un'incisione nel cranio attraverso la linea mediana.
Alla sutura lambda, fai tagli nel cranio dalla linea mediana lateralmente verso l'orecchio su entrambi i lati per sbucciare il cranio per esporre il cervello. A partire dall'estremità rostrale, utilizzare una piccola spatola da laboratorio per sollevare delicatamente il cervello dal cranio per consentire la recisa dei nervi ottici. Continuare a lavorare delicatamente il cervello all'indietro, esponendo la superficie ventrale e utilizzare forcep fini per pizzicare con cura i nervi trigeminali vicino alla superficie ventrale del tronco encefalico per tagliarli.
Mettere la preparazione in una piastra di Petri di vetro riempita con soluzione di affezione a freddo e posizionare la piastra al microscopio di sezionamento. Tagliare i nervi facciali vicino al tronco encefalico per esporre i nervi vestibulocochleari. Usa le forcep fini per spingere le punte nella foramina dove il nervo vestibulocochlear esce il cranio il più lontano possibile.
Pizzicare per severare i nervi su entrambi i lati, lasciando la radice nervosa attaccata al tronco encefalico. Rimuovere le meningi e la vascucolatura dalla superficie ventrale del tronco encefalico vicino al corpo trapezoiato. Quindi pizzicare i restanti nervi cranici e il tessuto connettivo per liberare completamente il cervello dal cranio, facendo attenzione a preservare il midollo spinale rimanente, se possibile.
Per preparare la superficie del cervello per l'apparecchio allo stadio posizionare il lato ventrale cerebrale verso l'alto e utilizzare uno strumento smussato per immobilizzare delicatamente il midollo spinale per stabilizzare il tessuto cerebrale. Inserire le forcep aperte con un angolo di circa 20 gradi attraverso il cervello fino alla parte inferiore del piatto in modo che le punte escano dalla superficie dorsale del cervello caudale al chiasmo ottico e utilizzare una lama di rasoio per tagliare lungo le forcep. Quindi, preparare un blocco di un centimetro cubo del 4%agar e stendere una piccola goccia di colla in un rettangolo sul palco.
Utilizzare le forcep per sollevare con cura il cervello e tamponare delicatamente il liquido in eccesso con il bordo di un tovagliolo di carta. Quindi posizionare la superficie bloccata sulla colla in modo che la superficie ventrale sia rivolta verso la direzione della lama durante l'affettamento e spingere delicatamente il blocco di agar contro la superficie dorsale come supporto. Per acquisire fette di cuneo con la radice nervosa cocleare sul lato spesso e i neuroni olivocochleari mediali e il nucleo mediale del corpo trapezoiato sul lato sottile, posizionare il disco magnetico con il cervello attaccato sul supporto dello stadio e posizionare il supporto nella camera di affezione di un vibratome con la superficie ventrale del cervello orientata verso la lama.
Riempire la camera con soluzione di affettamento ghiacciato e abbassare la lama nella soluzione a bolle di carbogeno. Tagliare le fette caudali nella regione di interesse per assicurarsi che le fette siano simmetriche. Quindi spostare lo stadio di circa 15 gradi da un lato.
Continuare a affettare attentamente fino a quando la radice del nervo uditivo è vicina alla superficie su un lato e il nervo facciale può essere visto sulla superficie dell'altro lato della fetta. Spostare lo stadio di 15 gradi nella posizione originale e allontanare la lama dal tessuto. Ruotare la base dello stadio di 90 gradi in modo che il bordo laterale del lato sottile sia rivolto verso la lama e abbassare la lama diverse centinaia di micron prima di avvicinare lentamente la lama al bordo del tessuto.
Con la lama retratti leggermente abbassare la lama allo spessore desiderato del bordo sottile della fetta. Spostare la lama indietro dal tessuto e ruotare indietro la base del palco in modo che la superficie ventrale sia di fronte alla base del palco. Effettuare un taglio per designare la superficie rostrale della fetta di cuneo e trasferire la fetta su un pezzo quadrato di carta di interfaccia caudle superficie verso il basso.
Il nervo facciale dovrebbe essere visibile su entrambi gli emisferi della fetta sulla superficie rostrale. Quindi spostare la fetta in una camera di incubazione di 35 gradi Celsius per recuperare per 30 minuti. Per impostare la fetta di cuneo per l'analisi elettrofisiologia, posizionare il campione in una camera di registrazione che viene continuamente perfusa con 35 gradi Celsius ACSF e stabilizzare la fetta.
Utilizzando l'ottica DIC, concentrarsi sulla radice del nervo uditivo sul lato spesso della fetta e utilizzare un micromanipolatore per spostare l'elettrodo stimolante del tungsteno bipolare sulla radice nervosa uditivo e delicatamente nella superficie del tessuto. Spostare il campo visivo verso il nucleo ventrale del corpo trapezoidico sul lato sottile e selezionare un neurone olivocochlear mediale come bersaglio per l'elettrofisiologia del morsetto patch sotto epifluorescenza utilizzando un filtro di emissione da 561 nanometri. Riempire una pipetta di registrazione con la soluzione interna appropriata per l'esperimento proposto e sotto la patch ottica DIC e registrare dal neurone olivocochlear mediale nella configurazione a celle intere.
Regolare l'ampiezza della stimolazione elettrica della radice nervosa uditivo per ottenere eventi postsinaptici coerenti nel neurone olivocochlear mediale. Quindi eseguire protocolli di stimolazione appropriati per osservare le correnti sinaptiche evocate nei neuroni olivocochleari mediali. Questa preparazione della fetta di cuneo è progettata per contenere la radice nervosa uditivo e il nucleo cocleare contralaterale ai neuroni olivocochleari mediali mirati per le registrazioni.
In questa fetta di cuneo resezionato macchiato di viola cresile il nucleo cocleare è presente in quasi tutta la sua estensione rostrale-caudale. E la radice nervosa uditivo si osserva entrare nel nucleo cocleare. Inoltre, la fetta di cuneo contiene neuroni del nucleo mediale del corpo trapezio ipsilaterale ai neuroni olivocochleari mediali da cui vengono eseguite le registrazioni.
Per confermare la connettività neuronale all'interno di una fetta di cuneo gli input presnaptici vengono stimolati in due modi. In primo luogo, la striatura acustica ventrale alla linea mediana viene stimolata elettricamente, attivando direttamente gli assoni t-stellati e il nucleo mediale dei neuroni del corpo trapezoidali attraverso la stimolazione dell'assone globulare delle cellule folte e con conseguente correnti postsinaptiche che vengono misurate al neurone olivocochleare mediale. La radice nervosa uditivo viene quindi stimolata ad attivare l'intero circuito del tronco encefalico ascendente mono e a evocare risposte postsinaptiche.
Il confronto delle misure di latenza di esordio della prima corrente postinaptica evocata con la stimolazione diretta della striata acustica ventrale con quelle evocate con stimolazione nervosa uditivo rivela una latenza significativamente più lunga nell'evento di stimolazione nervosa uditivo, indicativa del ritardo sinaptico risultante dall'ulteriore sinapsi del nucleo cocleare attivata durante la stimolazione nervosa uditivo. L'uso di punti di riferimento anatomici e un'attenta manovra dello stadio del disco magnetico sono fondamentali per creare fette di cuneo con circuiti neuronali intatti e risposte post sinaptiche evocate affidabili. Questa tecnica di affettare fornisce una piattaforma per l'utilizzo di ulteriori strumenti di elettrofisiologia in vitro tra cui l'imaging di calcio o tensione, l'optogenetica, lo sconvolgimento del neurotrasmettitore e la farmacologia sia intracellulare che extracellulare.
