Beyin dilimi deneyleri yüksek elektriksel ve zamansal çözünürlük ile nöronal fonksiyon sorgulama sağlar, ama bu dilimler genellikle birçok presinaptik bağlantıları sever. Kama şeklindeki bir dilim daha sağlam bir presinaptik devre korur. Bu modifiye beyin dilimi in vitro deney yararları sağlarken vivo benzeri nöronal devre daha eksiksiz korur, görsel güdümlü yama kıskaç kayıtları gibi, farmakoloji, ve aktivite görüntüleme.
Doğru kama dilimlenmiş geometri devre içindeki nöronların atlas konumlarına göre tahmin edilebilir, ancak presinaptik şema ve aksonların bütünlüğü histoloji kullanılarak belirlenmelidir. Burundan boynun arkasına kadar kafatasının orta ucundaki deriyi kesmek için bir jilet kullanarak başlayın. Kafatası nı ortaya çıkarmak için ve kafatasının tabanından başlayıp buruna doğru devam etmek için derini geri soyun, orta hattan kafatasında bir kesi yapmak için küçük makas kullanın.
Lambda sütür de, beyin ortaya çıkarmak için kafatası geri soymak için her iki tarafta kulak doğru yanal orta hattan kafatası nda kesikler yapmak. Rostral ucundan başlayarak, optik sinirlerin kesilmesine izin vermek için beyni kafatasından hafifçe kaldırmak için küçük bir laboratuvar spatulası kullanın. Yavaşça geriye doğru beyin çalışmaya devam, ventral yüzey açığa ve dikkatle onları kesmek için beyin sapı ventral yüzeye yakın trigeminal sinirleri çimdik için ince forceps kullanın.
Soğuk dilimleme çözeltisi ile dolu bir cam Petri kabına preparat yerleştirin ve bir kesme mikroskobu altında çanak yerleştirin. Vestibulocochlear sinirleri ortaya çıkarmak için beyin sapına yakın yüz sinirleri kırpın. Vestibulocochlear sinir mümkün olduğunca kafatası çıkar foramina içine ipuçları itmek için ince forseps kullanın.
Çimdik her iki tarafta sinirleri kesmek için, beyin sapı bağlı sinir kökü bırakarak. Menenjler ve yamuk vücut yakınındaki beyin sapı ventral yüzeyinden vaskülatür çıkarın. Sonra kalan kranial sinirler ve bağ dokusu kafatası tamamen beyin serbest bırakmak için çimdik, kalan omurilik korumak için özen, mümkünse.
Sahne fikstür için beyin yüzeyini hazırlamak için beyin ventral tarafı kadar yerleştirin ve yavaşça beyin dokusu stabilize etmek için omurilik hareketsizleştirmek için künt bir araç kullanın. Uçları optik kiasm için beyin kaudal sırt yüzeyinden çıkmak ve forceps boyunca kesmek için bir jilet kullanın böylece çanak altına beyin yoluyla yaklaşık 20 derecelik bir açıyla açık forceps yerleştirin. Sonra, % 4 agar bir metreküp blok hazırlamak ve sahnede bir dikdörtgen içine tutkal küçük bir damla yayıldı.
Dikkatle beyin kaldırmak ve nazikçe bir kağıt havlu kenarı ile aşırı sıvı dab forseps kullanın. Daha sonra bloke yüzeyi tutkal üzerine yerleştirin, böylece ventral yüzey dilimleme sırasında bıçağın yönüne bakacak ve agar bloğunu destek olarak sırt yüzeyine hafifçe itin. Kalın tarafında koklear sinir kökü ve medial olivocochlear nöronlar ve ince tarafta trapez vücudun medial çekirdeği ile kama dilimleri elde etmek için, sahne tutucu üzerine bağlı beyin ile manyetik disk yerleştirin ve bıçak doğru doğru beynin ventral yüzeyi ile bir vibratom dilimleme odasına tutucu yerleştirin.
Buz gibi dilimleme çözeltisi ile hazneyi doldurun ve bıçağı karbogen kabarcıklı çözeltiye indirin. Dilimlerin simetrik olduğundan emin olmak için dilimleri ilgi çekici bölgeye kesin. Sonra sahneyi yaklaşık 15 derece bir tarafa kaydırın.
İşitsel sinir kökü bir tarafta yüzeye yakın olana ve yüz siniri dilimin diğer tarafında ki yüzeyde görülene kadar dikkatlice dilimleme devam edin. Sahne yi 15 derece geri orijinal konuma kaydırın ve bıçağı dokudan uzaklaştırın. Sahne tabanını 90 derece döndürün, böylece ince tarafın yanal kenarı bıçakla karşı karşıya dır ve bıçağı yavaşça dokunun kenarına yaklaştırmadan önce bıçağı birkaç yüz mikron düşürün.
Bıçak ile biraz dilim ince kenarına istenilen kalınlıkta bıçak daha düşük geri çekilir. Bıçağı dokudan geri hareket ettirin ve sahne tabanını geri döndürün, böylece ventral yüzey sahne tabanına dönük. Kama diliminin rostral yüzeyini belirlemek için bir kesim yapın ve dilimi bir santimetre karelik bir arayüz kağıdı caudle yüzeyine aktarın.
Yüz siniri, rostral yüzeydeki dilimin her iki hemisferinde de görülmelidir. Sonra 30 dakika kurtarmak için 35 derece santigrat santigrat kuluçka odasına dilim taşıyın. Elektrofizyoloji analizi için kama dilimini ayarlamak için numuneyi sürekli olarak 35 santigrat derece ACSF ile perfüze olan bir kayıt odasına yerleştirin ve dilimi stabilize edin.
DIC optik kullanarak, dilimin kalın tarafında işitsel sinir kökü odaklanmak ve işitsel sinir kökü ve yavaşça doku yüzeyine bipolar tungsten uyarıcı elektrot taşımak için bir mikromanipülatör kullanın. İnce tarafta trapez vücudun ventral çekirdeğine görüş alanı taşıyın ve bir 561 nanometre emisyon filtresi kullanarak epifloresan altında yama kıskaç elektrofizyolojisi için hedef olarak bir medial olivocochlear nöron seçin. Bir kayıt pipetini önerilen deney için uygun dahili çözümle doldurun ve DIC optik yama altında ve tüm hücre yapılandırmasında medial olivocochlear nörondan gelen kayıt.
Medial olivocochlear nöronda tutarlı postsinaptik olaylar elde etmek için işitsel sinir kökünün elektriksel stimülasyon genliğini ayarlayın. Sonra medial olivocochlear nöronlarda uyarılmış sinaptik akımları gözlemlemek için uygun stimülasyon protokolleri çalıştırın. Bu kama dilimi hazırlama işitsel sinir kökü ve koklear çekirdek kontralateral medial olivocochlear nöronlar kayıtları için hedeflenen içerecek şekilde tasarlanmıştır.
Bu terosyl menekşe lekeli kama dilimi koklear çekirdek neredeyse tam rostral-kaudal ölçüde mevcuttur. Ve işitsel sinir kökü koklear çekirdeğin girerken gözlenir. Buna ek olarak, kama dilimi kayıtları yapılır medial olivocochlear nöronlar için trapezoid vücut ipsilateral medial çekirdeğin nöronlar içerir.
Bir kama dilimi presinaptik girişleri içinde nöronal bağlantı onaylamak için iki şekilde uyarılır. İlk olarak, orta hattaki ventral akustik stria elektriksel olarak uyarılır, doğrudan T-stellat aksonları aktive ve küresel gür hücreli akson stimülasyonu ile trapezvücut nöronlarının medial çekirdeği ve medial olivocochlear nöron ölçülür postsinaptik akımlar sonuçlanan. İşitsel sinir kökü daha sonra tüm monaural yükselen beyin sapı devreetkinleştirmek ve postsinaptik yanıtları uyandırmak için uyarılır.
Ventral akustik strianın doğrudan uyarılması ile uyandırılabilen ilk postsinaptik akımın, işitsel sinir stimülasyonu ile uyarılmış olanlarla karşılaştırılması, işitsel sinir stimülasyonu olayında önemli ölçüde daha uzun bir gecikme yitirir, işitsel sinir stimülasyonu sırasında aktive edilen ek koklear çekirdek sinapsin den kaynaklanan sinaptik gecikmenin göstergesidir. Anatomik yerlerin kullanımı ve manyetik disk aşamasının dikkatli manevra bozulmamış nöronal devre ve güvenilir uyarılmış sonrası sinaptik tepkiler ile kama dilimleri oluşturmak için önemlidir. Bu dilimleme tekniği kalsiyum veya voltaj görüntüleme, optogenetik, nörotransmitter uncaging ve hem hücre içi hem de hücre dışı farmakoloji dahil olmak üzere ek in vitro elektrofizyoloji araçları kullanmak için bir platform sağlar.
