Поскольку FAP являются медиаторами регенерации мышц и патологического фиброза, наш протокол позволяет характеризовать динамику FAP после повреждения мышц и выделять FAP для исследований in vitro или ex vivo. На сегодняшний день исследования проводились исключительно на ФАПах, выделенных у мышей. Наш протокол позволяет эффективно изолировать FAP от более крупной крысы, обеспечивая гораздо большую доступность тканей для последующих анализов.
Длительное время обработки тканей может негативно повлиять на жизнеспособность ФАПов. Если одновременно обрабатывается несколько образцов, рекомендуется, чтобы два оператора выполняли протокол в тандеме, чтобы максимизировать жизнеспособность изолированной клетки. Начните с помещения собранной мышечной ткани в стерильную 10-сантиметровую чашку для культивирования клеток.
Аккуратно порвите и измельчите ткань щипцами и удалите соединительную ткань, чтобы получить примерно три-четыре миллиметровых кубических кусочка. Переложите минстерную ткань в стерильную 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую шесть миллилитров ДМЭМ и 1% пенициллина-стрептомицина. Далее активируют 365 микролитров раствора коллагеназы II путем добавления 10 микролитров 300-миллимолярного раствора хлорида кальция.
Добавьте активированный раствор коллагеназы II в тканевую суспензию для окончательной концентрации 250 единиц на миллилитр. Инкубируют пробирки в шейкере в течение одного часа и при температуре 37 градусов Цельсия при 240 х г с ручным перемешиванием каждые 15 минут для смещения ткани, прилипшей к боковой стороне трубки. После одного часа инкубации добавьте в образец 100 микролитров коллагеназы II и 50 микролитров диспазы.
Затем пипетка отбирается от 15 до 20 раз серологической пипеткой до тех пор, пока раствор не станет однородным. Снова инкубируйте образец в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 240 х г при ручном перемешивании каждые 15 минут. Медленно срезайте образцы мышечного раствора через 20-миллилитровый шприц с иглой 20-го калибра в течение 10 циклов.
Затем поместите 40-микронный клеточный ситечко на стерильную 50-миллилитровую коническую трубку и смочите ее, пипетируя пять миллилитров DMEM, дополненных 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином. Пипетка образца по одному миллилитру за раз через ситечко. После того, как весь образец отфильтрован, промыть клеточный ситечко DMEM, дополненным 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином, чтобы довести общий объем образца до 25 миллилитров.
Разделите объем образца поровну на две 15-миллилитровые конические трубки и центрифугу при 15 градусах Цельсия, 400 х г в течение 15 минут. После центрифугирования аспирируют супернатант и повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре буфера лизиса эритроцитов при комнатной температуре в течение семи минут. Затем добавьте девять миллилитров промывочного буфера, чтобы довести объем до 10 миллилитров и центрифугу при 15 градусах Цельсия, 400 х г в течение 15 минут.
После центрифугирования аспирируют супернатант и повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре промывочного буфера. Переложите соответствующий объем клеток в отдельную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и смешайте ее с красителем трипан-синего цвета. Подсчитывайте живые клетки на световом микроскопе с помощью гемоцитометра.
Для проточной цитометрии перенесите от одной до 2 миллионов клеток на экспериментальный образец в стерильную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Доведите объем образца до одного миллилитра с помощью промывочного буфера и поместите трубку на лед. Настройте все элементы управления для эксперимента.
Для клеточного контроля аликвотирует от 500 000 до 1 миллиона клеток в одном миллилитре промывочного буфера в 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке и поместите его на лед. Если эксперимент проводится впервые, следует также включить одноокрашенные клеточные суспензии. Чтобы настроить элементы управления шариками, добавьте около 150 000 шариков с положительной компенсацией к каждой маркированной 1,5-миллилитровой центрифужной трубке.
Подготовьте контроль жизнеспособности, перенеся половину объема ячейки из трубки жизнеспособности в обновленную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, помеченную как мертвая. Высиживают мертвую трубку при 65 градусах Цельсия в течение двух-трех минут, затем кладут ее на лед. После инкубации верните мертвые клетки в трубку жизнеспособности.
Центрифугируйте одноэлементные суспензии, включая экспериментальные и контрольные образцы при 500 х г и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, и повторно суспендируйте гранулы клеток в 100 микролитрах промывочного буфера после аспирации супернатанта. Добавьте антитела в соответствии с контрольными или экспериментальными условиями и осторожно проведите по образцу, чтобы обеспечить полное перемешивание. Затем высиживают их на льду в темноте в течение 15 минут.
Для компенсации бусины высиживают трубку при комнатной температуре в темноте в течение 15 минут. Доведите объем каждого образца до одного миллилитра, добавив 900 микролитров промывочного буфера к одноэлементной суспензии и 900 микролитров PBS для управления компенсационным шариком. Центрифуга одноэлементных суспензий при 500 х г и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, а компенсационные шарики контролируют при 300 х г и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.
После центрифугирования образцов аспирируют супернатант и повторно суспендируют клеточную гранулу в 300 микролитрах буфера промывки, а контроль шариков в 300 микролитрах PBS и 150 000 бусин с отрицательной компенсацией. Храните образцы клеток на льду и образцах шариков при комнатной температуре под алюминиевой фольгой. Приступайте к приобретению проточной цитометрии, устанавливая стратегию гатинга для выявления фибро-адипогенных предшественников и миогенных предшественников.
В репрезентативном анализе была подтверждена успешная конъюгация антитела Sca-1 APC с однократным окрашиванием компенсационных шариков и клеточных суспензий, полученных из здоровой икроножной мышцы крысы. Пять различных концентраций Sca-1 APC были титрованы на одноклеточных суспензиях, и оптимальная концентрация антител была идентифицирована на основе наибольшей интенсивности флуоресценции с минимальным фоновым окрашиванием. Проточная цитометрическая идентификация ФАПов и МП у икроножной мышцы крыс была выполнена с использованием стратегии гатинга, показанной здесь.
Образцы были сначала закрыты, чтобы исключить мусор в счетных бусинах. Затем ячейки были закрыты, чтобы исключить дублеты как по характеристикам переднего рассеяния, так и по характеристикам бокового рассеяния. Жизнеспособность полученных клеток оценивали окрашиванием SYTOX Blue.
Отрицательные синглеты SYTOX Blue оценивались на CD31 и CD45 для исключения фракций Lin+. Оценивалась линьская популяция. Ячейки, которые были единственными положительными для Sca-1, были обозначены FAP, а ячейки, которые были единственными положительными для VCAM-1, были назначены депутатами.
При коиммуноранении сразу после сортировки свежеизолированная популяция ФАП показала положительное окрашивание pdgfRalpha без загрязнения положительными клетками Pax7. И наоборот, отсортированная популяция депутатов окрашена положительно для Pax7 с отсутствием PDGFRalpha-положительных клеток. ФАПы продемонстрировали дифференцированные фибробласты и адипоциты на 12-й день в адипогенных дифференцировочных средах с экспрессией фибробласт-специфического белка 1 и перилипина 1 соответственно.
Присутствие нейтральных триглицеридов и липидов из зрелых адипоцитов было очевидно при окрашивании Oil Red O. Кроме того, FAPs продемонстрировали наличие коллагена типа I и отсутствие загрязняющих миоцитов. МП, выращенные в миогенных дифференцировочных средах на 12-й день, демонстрировали наличие зрелых миоцитов и слитых многоядерных миотрубок и были свободны от фибробластов и загрязнения адипоцитами.
При использовании этого метода для выделения живых клеток для долгосрочной культуры исследователи должны обеспечить использование асептической техники, одновременно эффективно работая для обеспечения хорошей жизнеспособности клеток.
