Одним из существенных барьеров в изучении внутримышечного жира, отличительной чертой саркопении и нервно-мышечных заболеваний, является эффективное сохранение и последующая визуализация адипоцитов, особенно в замороженных участках тканей. Протокол сохраняет морфологию адипоцитов и участки скелетных мышц, выровненные для надежной, строгой и воспроизводимой визуализации и количественной оценки внутримышечного жира. Наш аналитический конвейер обеспечивает основу для проверки новых вмешательств по предотвращению образования жира при таких заболеваниях, как мышечная дистрофия Дюшенна Демонстрацией процедуры будет Коннор Джонсон, техник-исследователь из моей лаборатории.
Для начала очистите ногу, чтобы ввести свежую спиртовую салфетку для дезинфекции. Наберите от 30 до 50 микролитров 50% глицерина в инсулиновый шприц. Аккуратно расчесайте волосы на голени, чтобы обнажить расположение ТА. После обнаружения ТА вставьте иглу в ТА дистально около лодыжки.
Полностью вставьте иглу в мышцу и медленно вводите глицерин, постепенно снимая иглу, которая помогает повредить большую часть мышцы. Обильно распылите любые участки мыши, которые будут разрезаны 70% этанолом, чтобы помочь волосам не рассечь область и инструменты. Используйте ножницы, чтобы разрезать кожу вокруг верхней части ноги возле таза.
Аккуратно потяните кожу ноги сверху вниз до лодыжки. Во-первых, удалите внешний слой соединительной ткани с помощью пинцета с острым кончиком перед сбором ТА. Сдвиньте пинцет под ТА от нижней части мышцы, начиная с дистального сухожилия и осторожно потяните вверх к колену. Остановитесь на конце мышцы.
Не проталкивайте сопротивление, ощущаемое в нижней части колена. Если есть значительное сопротивление до достижения нижнего колена, остановитесь и продолжайте удаление оставшихся слоев соединительной ткани. После того, как ТА был частично поднят с ноги пинцетом, используйте то же движение скальпелем, чтобы разорвать соединение ТА с нижним коленом.
Потрошите сухожилие на лодыжке ножницами, чтобы полностью удалить ТА. Обрабатывайте мышцу только на сухожилии, чтобы избежать повреждения волокон. Отрежьте одну треть ТА на конце, напротив сухожилия. Поместите его в микроцентрифужную трубку и заморозьте, сбросив в жидкий азот.
Погрузите остальные две трети ткани в меченый колодец с 4% PFA для гистологии. Обязательно следите за тем, когда первая и последняя ткань были помещены в фиксатор. Поместите на нутатор на два-два с половиной часа при четырех градусах Цельсия.
После фиксации удалите ПФА из скважин. Промойте салфетки холодным одним X PBS два-три раза, а затем мойте два-три раза холодным 1X PBS в течение пяти минут за стирку. Удалите PBS из лунок и добавьте достаточное количество 30% сахарозы в 1X PBS, чтобы позволить ткани плавать.
Поместите на нутатор при четырех градусах Цельсия на ночь. Включите микроскоп и запустите программное обеспечение для обработки изображений. Закрепите слайд на сцене.
Используйте любой канал для определения области, которую необходимо визуализировать. В программном обеспечении для обработки изображений отрегулируйте коэффициент усиления и время экспозиции для каждого канала. Сделайте снимки всей ткани в каждом канале и объедините отдельные плитки, чтобы сделать композит полного поперечного сечения TA.
Перед началом разогрейте без РНК воду до 45 градусов Цельсия и приготовьте свежий 70% этанол. Добавьте 1000 микролитров тиоцианата гуанидиния в каждую пробирку, содержащую образец. Важно, чтобы использовались трубки, одобренные Bead Beater.
Добавьте три средних бусины или одну большую и одну маленькую бусину в каждый тюбик. Гомогенизируйте ткань при 50 Гц в течение двух-четырех минут с помощью бисерного beater. В зависимости от типа ткани и размера образца это может занять до 10 минут.
добавить 200 микролитров хлороформа. Встряхните образцы в течение 15 секунд. Инкубировать в течение двух-трех минут при комнатной температуре.
Центрифугу в течение 15 минут в 12 000 раз G.Pipette выводят 350 микролитров прозрачного супернатанта и добавляют в новую микроцентрифугу трубку, содержащую 350 микролитров 70% этанола. Будьте осторожны, чтобы не аспирировать нижние слои белка и / или ДНК. Переложите до 700 микролитров этой смеси в мини-отжимную колонну, помещенную в двухмиллилитровую коллекторную трубку.
Продолжайте выделение РНК в соответствии с инструкциями производителя. Elute с 30-50 микролитрами воды без РНКазы, в зависимости от ожидаемого выхода. Держите РНК на льду и измеряйте выход с помощью спектрофотометра.
Храните РНК при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Используйте до одного микрограмма РНК для синтеза кДНК с помощью набора для синтеза кДНК в соответствии с инструкциями производителя. После завершения пробега добавьте 80 микролитров воды без РНКазы.
Храните образцы при минус 20 градусах Цельсия. Используя формат 384 скважины, добавьте один микролитр грунтовки на дно каждой скважины. Свободные сушильные грунтовки приводят к более плотным техническим репликам.
Оставьте покрытыми до полного испарения грунтовок. Настройте реакции образцов с четырьмя-восемью техническими репликами. После завершения ПЦР нормализуйте пороговые значения сырого цикла до уровней генов домашнего хозяйства и определите изменения складки путем расчета дельта-дельта Ct.Перилипин и положительные адипоциты из нефиксированных ТА значительно изменили морфологию по сравнению с фиксированными участками, что делает их идентификацию, визуализацию и последующую количественную оценку гораздо более сложными и потенциально неточными.
Напротив, фиксация PFA сохраняет морфологию адипоцитов, что позволяет точно обнаруживать внутримышечный жир. По сравнению с неповрежденной мышцей ТА, глицериновое повреждение вызывает экспрессию ранних адипогенных маркеров, таких как гамма PPAR и CEBP альфа, уже через три дня после травмы. Зрелые маркеры, такие как адипонектин и перилипин, могут быть обнаружены уже через пять дней после повреждения глицерином.
Используя генетическое отслеживание родословной, большинство альфа-ФАП рецепторов PDGF экспрессируют маркер линии EYFP. Через семь дней после повреждения глицерином EYFP-положительные FAP превратились в EYFP-положительный перилипин, экспрессирующий адипоциты, демонстрируя, что FAP действительно являются клеточным происхождением внутримышечного жира. Протокол также может быть адаптирован для визуализации миогенного компартмента.
Используя антитела против PAX7 и MYOD1, мышечные стволовые клетки и маркеры миобластов, соответственно, могут быть легко обнаружены через пять дней после повреждения глицерином, даже в фиксированных участках мышечной ткани PFA. Этот протокол также может быть адаптирован для визуализации и количественной оценки адипоцитов и других взрослых тканей. Кроме того, наша техника сохранения тканей совместима с различными техниками стояния.
