Нормальное кровоснабжение улитки критически важно для болезни улитки Меньера, особенно для поддержания кохлеарного потенциала в помещении, который является важной движущей силой для транзакции волосковых клеток. Эта функция кровообращения была тесно связана с различными формами потери слуха. Лучшее понимание кохлеарного кровотока позволит более эффективно управлять нарушениями слуха, вызванными дисфункцией кровотока.
Тем не менее, прямое измерение кровотока очень сложно из-за сложности оценки внутреннего уха. Методы оценки кохлеарного кровотока в настоящее время все еще находятся в стадии разработки. Здесь мы демонстрируем один из последних методов, установленных в нашей лаборатории, открытое мышечное окно в аккомодации с флуоресцентным микроскопом высокого разрешения для сужения кохлеарного кровотока у мелких видов животных, таких как мыши.
Применение этого метода с трансгенетическими моделями массы имеет потенциал для продвижения исследований по разгадке связей между функцией слуха и патологией, связанной с кохлеарным кровотоком во внутрисосудистом риске. Наши процедуры следует проводить с осторожностью. В дополнение к кратковременному кровоизлиянию в тело, жизненно важные показатели животного, включая кровяное давление и сердцебиение, должны контролироваться во время операции.
Начните со сбора примерно одного миллиметра крови в гепарине путем пункции сердца. Центрифугируйте кровь в 3000 раз G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. Извлекают плазму, затем промывают гранулу клеток крови одним миллилитром PBS три раза центрифугированием в 3000 раз G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия.
Маркируйте клетки крови одним миллилитром 20 микромоляров DiO или Dil в PBS и инкубируйте в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре. Промыть меченые клетки крови одним миллилитром PBS и трижды центрифугировать по 3000 раз G в течение трех минут. Перед инъекцией повторно суспендируют клеточную гранулу в 30% гематокрите с примерно 0,9 миллилитрами PBS.
Подготовьте стерильные хирургические инструменты и платформу для визуализации и поместите грелку под драпировку. Следите за плохим рефлекторным и общим мышечным тонусом обезболенных мышей, чтобы проверить глубину анестезии. Поместите животное на теплую грелку и его хвост в систему мониторинга для контроля артериального давления и сердцебиения.
Поддерживайте ректальную температуру на уровне 37 градусов цельсия и регистрируйте систолическое артериальное давление животного, диастолическое артериальное давление и среднее артериальное давление в анестезированном состоянии. Откройте левую барабанную перепонку с помощью бокового и вентиляционного подхода под стереомикроскопом, оставив барабанную перепонку и косточки нетронутыми. Сделайте разрез вдоль средней линии шеи животного с обездвиженной головой, чтобы свести к минимуму движение.
Удалить левую подчелюстную железу и задний брюхо дигастральной мышцы и прижечь. Найдите и обнажите костную буллу, идентифицируя грудино-ключично-сосцевидную мышцу и лицевой нерв, простирающийся спереди к булле. Откройте костную буллу иглой 30 калибра и аккуратно удалите окружающую кость хирургическим пинцетом, чтобы обеспечить четкое представление о кохлеарной и стапедиальной артерии с ее медиальным краем, лежащим над краем круглой оконной ниши и вызывающим переднее верхнее к овальному окну.
Используйте небольшое лезвие ножа, чтобы соскоблить кость боковой стенки на вершинном среднем повороте улитки мыши примерно в 1,25 миллиметрах от вершины, пока не треснет тонкое пятно. Удалите костные сколы небольшими проволочными крючками. Накройте окно сосуда вырезанным крышкой, чтобы сохранить нормальные физиологические условия и обеспечить оптический вид для записи изображений сосуда.
Сделайте сантиметровый разрез вдоль правой подкожной вены, чтобы обнажить сосуд. Последовательно вливайте 100 микролитров каждого раствора FITC-Декстрана и суспензии клеток крови в животное через подкожную вену, чтобы обеспечить визуализацию кровеносных сосудов и отслеживание кровотока. Наблюдайте за кровотоком в режиме реального времени на видеомониторе через пять минут после инъекции.
Визуализируйте кровеносные сосуды с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом на большом рабочем расстоянии и корпусом лампы, содержащим многополосный фильтр возбуждения и совместимый эмиссионный фильтр. Записывайте видео с помощью цифровой черно-белой камеры с зарядовой связью высокого разрешения, получая более 350 изображений на видео. Обеспечить успешный анализ скорости потока.
Измерьте диаметр сосуда с помощью соответствующего программного обеспечения и определите расстояние между двумя фиксированными точками по всему сосуду на полученных изображениях. Откройте видео кровотока в программном обеспечении и установите масштаб изображений. Отслеживайте выбранные DiO окрашенные клетки крови с помощью функции отслеживания.
Затем используйте расстояние, на которое переместились ячейки, и интервал времени между кадрами изображения в видео для автоматического расчета скорости потока. Рассчитайте объемный поток, используя уравнение, приведенное в тексте рукописи. Чтобы создать модель воздействия шума перед записью кровотока, поместите животных в клетки из проволочной сетки и подвергните их широкополосному шуму при уровне звукового давления 120 децибел в кабине для звуковой экспозиции в течение трех часов.
Затем еще на три часа на следующий день. Записывайте кровоток через две недели после воздействия шума. После хирургического воздействия кохлеарных капилляров в боковой стенке через открытое окно сосудов проводилось прижизненное флуоресцентное микроскопическое наблюдение за мечеными DiL клетками крови в сосудах, меченных FITC Dextran.
Меченые DiL клетки крови в сосудах Stria, помеченные FITC Dextran, показаны здесь. Меченые Dio клетки крови, помеченные FITC Dextran, показывают, что плотность сосудов спиральной связки более разрежена, чем у более плотной Stria vascularis. IVM с высоким разрешением показывает паттерны кровотока в контрольных и шумовых группах.
Нарушенный рисунок кровообращения можно увидеть в группах, подвергшихся воздействию шума. Аномалии включали уменьшение диаметра сосуда и увеличение вариаций диаметра сосуда. Скорости кровотока в контрольной и шумовой группах были рассчитаны путем отслеживания корней меченых DiO клеток крови.
Скорость и объем крови в группе, подвергшейся воздействию шума, были значительно ниже, чем в контрольной группе. Успешное установление открытого сосудистого окна требует высокой степени хирургического мастерства. Необходимо проявлять осторожность при удалении кости кохлеарной боковой стенки.
