Настоящий протокол описывает меру обнаружения параклеточной проницаемости in vivo для оценки функции плотных эндотелиальных соединений в подчелюстных железах мыши. Двухфотонная лазерная сканирующая микроскопия, тем не менее, не только имеет преимущество обычной конфокальной микроскопии, но также может быть использована для более глубокого обнаружения ткани и изображения более четко. Этот эксперимент обеспечивает хороший метод измерения для оценки проницаемости сосудов различных тканей, особенно поверхностных тканей и органов животных.
Начните с выбора соответствующих индикаторов, таких как флуоресцеин, изотиоцианат, меченый декстран и родамин B, меченый декстран с различными спектрами излучения возбуждения, чтобы свести к минимуму помехи между флуоресцентными сигналами для анализа проницаемости. Разбавьте следы в стерильный фосфатный буферизованный физиологический раствор до 100 миллиграммов на миллилитр запасов и храните аликвоты, защищенные от света, при минус 20 градусах Цельсия. После обезболивания самца мыши дикого типа в возрасте от 8 до 10 недель осторожно удерживайте голову и шею мыши, чтобы одна сторона глазного яблока слегка выступала.
Вставьте инсулиновый шприц, содержащий 100 микролитров смеси флуоресцентного индикаторного раствора вдоль уголка глаза под прямым углом к глазу. После инъекции быстро поместите мышь на картон в лежачем положении с заклеенными конечностями и головой. Для выделения подчелюстной железы или SMG под стереоскопическим микроскопом разрезают эпидермис шеи общими тканевыми ножницами, чтобы обнажить обе стороны SMG.
Затем используйте тупую иглу для разделения тканей, чтобы аккуратно отделить капсулу от поверхности железы, не повреждая ткань железы, кровеносные сосуды и железистую структуру. Подключите настроенный держатель к устройству отрицательного давления и заранее проверьте, правильно ли достигнут эффект отрицательного давления. Осторожно поместите открытый SMG на настроенный держатель и всасывайте ткань путем всасывания отрицательного давления, как можно дальше от тела мыши, чтобы уменьшить артефакты движения, вызванные дыханием и другими условиями.
Начните визуализацию вскоре после того, как будет выбран участок железы. Получение последовательных изображений вдоль оси Z, шагнувшей на два микрона от поверхности железы до 70-140 микрон в ткань для создания трехмерной конструкции. Затем получите покадровую визуализацию сосудов для измерения проницаемости сосудов в СМГ.
В диалоговом окне проводника нажмите «Добавить новую папку» и измените имя файла. Затем вернитесь к столбцу приобретения. В XY формат 512 на 512, а скорость 400 герц.
Включите двунаправленный X", установите коэффициент масштабирования 0,75 и 1,5 для масштабирования. Затем выберите XYT в разделе «Режим сбора», чтобы получить покадровое изображение. Установите продолжительность 20 секунд, 30 минут или дольше в соответствии с экспериментальной потребностью.
После установки условий нажмите «Live», чтобы наблюдать за сосудистой визуализацией двух каналов и перекрывающихся каналов в фотообразующей рамке и выбрать интересующие области. Нажмите «Пуск», чтобы начать создание образа. Анализ проницаемости сосудов in vivo и трехмерные изображения кровеносных сосудов у мышей.
Здесь показаны подчелюстные железы. В контрольной группе оба индикатора существовали в кровеносных сосудах СМГ. Благодаря своей небольшой молекулярной массе, FD4 смог просачиваться из кровеносных сосудов на базальные стороны ацинушек и протоков, тем самым четко изображая форму ацинушек и протоков.
RD70 распределялся по кровеносным сосудам большого размера и микрососудам. В группе лигирования протоков как FD4, так и RD70 экстравазировали на базальные стороны ацинов, что указывало на то, что лигирование протоков может нарушить эндотелиальную барьерную функцию и увеличить проницаемость для больших молекул. Кроме того, полуколичественные результаты интенсивности флуоресценции FD4 и RD70 подтвердили эти наблюдения.
Трехмерные изображения показали гораздо более скрытую флуоресценцию FD4 и RD70 вокруг кровеносных сосудов в группе лигирования по сравнению с контрольной группой. Тщательная изоляция SMG и соответствующее размещение и микроскоп являются необходимыми предпосылками для успешного обнаружения. После процедур скорость кровотока может быть рассчитана путем объединения движения красных кровяных клеток, и инфильтрация флуоресцентных меченых клеток крови может быть преследуема.
