Этот протокол обеспечивает простую стратегию для создания клеточных культурных моделей белых и коричневых адипоцитов, которые точно повторяют in vitro физиологию жировой ткани, которую мы имеем in vivo. Этот протокол позволяет одновременно выделять как белые, так и коричневые преадипоциты у новорожденных мышей, а клетки, которые мы изолируем с помощью этого метода, оценивают высокую пролиферативную способность и дифференцировонный потенциал. Клетки, выделенные с использованием этого подхода, отражают сложность жировой ткани лучше, чем другие модели культуры.
И его можно использовать для более точного изучения функции адипоцитов при ожирении и диабете. Мы фокусируемся в первую очередь на понимании дисфункции жировой ткани при ожирении. Тем не менее, клетки, полученные с помощью этого метода, также могут быть использованы для изучения основных вопросов о клетке в биологии развития.
Ключом к успешному эксперименту является определение того, как идентифицировать белые адипо, поскольку эти депо, которые являются небольшими, но очень богатыми и пролиферирующими преадипоцитами, может быть трудно различить у детенышей. Визуальная демонстрация иллюстрирует, насколько прост этот протокол, и позволяет предоставлять советы по обнаружению и рассечению белых и коричневых адипозных складов. Видеть изоляцию депо очень полезно.
Чтобы собрать подкожную белую жировую ткань, разрежьте кожу вокруг живота усыпленного новорожденного щенка, и аккуратно потяните кожу ниже ног. Не собирая никаких кожных тканей, тщательно соберите жировое депо, которое будет выглядеть как прозрачная или белая, тонкая удлиненная ткань, прикрепленная к внутренней части кожи или поверх квадрицепсов. Промыть собранный депо в PBS и поместить жировую ткань в 1,5-миллилитрную трубку, содержащую 250 микролитров PBS и 200 микролитров 2X изоляционного буфера на льду.
Чтобы собрать межлопапатку коричневой жировой ткани, вытяните кожу с лопаток над головой и поднимите темно-красную коричневую жировую ткань, расположенную между лопатками. Осторожно сделайте разрезы по всему жиру, чтобы отсоедить его от тела и проверить ткань на консистенцию и цвет. После промывки поместите ткань во вторую 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 250 микролитров PBS и 200 микролитров 2X изоляционного буфера на льду.
Когда все депо будут собраны, используйте ножницы, чтобы аккуратно изрезать каждое депо четыре-шесть раз непосредственно внутри трубок и добавить 50 микролитров коллагеназы 10X в буфере изоляции 2X в каждую трубку. Затем быстро переверняйте трубки, чтобы перемешать и поместить ткани в смеситель с контролируемой температурой в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия и 1400 оборотах в минуту. В конце пищеварения поместите трубки обратно на лед и отфильтруйте пищеварительные ткани через 100-микронные клеточные ситечики в новые 50-миллилитровые трубки.
Чтобы максимизировать выход ячейки, промойте каждую трубку одним миллилитром изоляционного вещества и фильтруйте эту промывку через ситечко. Разбавляют бурые и белые растворы жировой ткани до двух миллилитров тканевой суспензии на лунку на депо в свежей изоляционной среде. Затем накладываем два миллилитра суспензии белой жировой ткани в каждую из четырех-шести лунок и два миллилитра суспензии бурой жировой ткани в каждую из двух-трех лунок шестищелочной пластины через один 100-микрон фильтр на лунку.
Когда все клетки будут покрыты, поместите пластину в инкубатор клеточной культуры на 60-90 минут. В конце инкубации промыть каждую лунку двумя миллилитрами безымянного носителя и осторожно перемешать пластину, чтобы отсоединить любые клетки крови от дна лунок. После трех промывок добавить в лунки два миллилитра свежей изоляционной среды и вернуть пластину в инкубатор клеточных культур.
Когда клетки достигнут слияния от 80 до 90%, покрывать новые тарелки назначения стерильным 0,1% желатина в дистиллированной воде при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Пока пластины инкубируются, промыть клетки PBS перед обработкой трипсином в течение трех минут в инкубаторе клеточной культуры. Когда клетки отсоединяются, пипетка клеточной суспензии несколько раз, чтобы максимизировать восстановление клеток и перенести клетки в новую трубку.
Когда все клетки будут собраны, промыть каждую лунку одним миллилитром изоляционного средства и вытащить промывки с клеточной суспензией. Соберите ячейки путем центрифугирования и повторно суспендировать гранулу в трех-пяти миллилитрах изоляционной среды для подсчета. Разбавьте клетки до соответствующей концентрации для нанесения покрытия в свежей изоляционной среде и промыть пластины с желатиновым покрытием PBS, чтобы удалить избыток желатина.
Затем посейте клетки на пластины, покрытые желатином, и верните клетки в инкубатор клеточной культуры. Когда клетки достигнут слияния, замените изоляционную среду средой дифференцировки. При дифференциации преадипоцитов бурой жировой ткани добавляют также один наномолярный трийодтиронин.
Через 48 часов обновите среду соответствующим объемом поддерживающей среды на культуру. В это время скопление мелких капель жидкости внутри клеток должно стать видимым при ярко-полевой микроскопии. Даже после фильтрации некоторые клеточные обломки и клетки крови остаются внутри клеточной суспензии.
Мягкие промывки через час после покрытия удаляют нерелевантные клетки, поскольку преадипоциты быстро прикрепляются к дну колодца. Хотя как белые, так и коричневые преадипоциты, выделенные из новорожденных щенков, обладают высокой пролиферативной способностью, выход белых преадипоцитов, как правило, в два раза выше, чем у коричневых преадипоцитов на основе депо. Поэтому, если желательны синхронизированные культуры, эта начальная плотность белых преадипоцитов должна быть рассчитана соответствующим образом.
В конце дифференцировки клетки будут казаться загруженными липидными каплями и будут экспрессировать классические маркеры белых и коричневых адипоцитов соответственно. При данном сравнительном анализе потребления кислорода в митохондриальном стресс-тесте первичных белых и коричневых адипоцитов в базальных условиях, а также в ответ на известные стимуляторы митохондриальной функции можно наблюдать эти специфические биоэнергетические возможности каждого типа клеток. Помните, что мы изолируем живые клетки и хотим культивировать их в течение нескольких дней.
Поэтому обязательно поддерживайте стерильные условия во время изоляции, чтобы избежать загрязнения, которое может поставить под угрозу последующую культуру. Этот метод генерирует полностью зрелые адипоциты, которые могут быть использованы для различных применений, включая функциональные анализы, генетические или химические скрининги или профилирование омики для изучения клеточных автономных механизмов, которые влияют на функцию адипоцитов.
