Чтобы исследовать биологические аспекты коричневой жировой ткани, важно очистить очищенный коричневый жировой размер. В настоящее время нет входящих в коричневый жировой размер очистки и массы доступны. В этом исследовании мы разработали простой протокол для решения этой проблемы.
Теперь для этого протокола требуется один навык. Он требует гораздо меньше учебных материалов, чем другие методы, а очищенный размер коричневой жировой ткани может быть непосредственно использован для анализа экспрессии генов и белков. Этот протокол предоставляет новый метод изучения биологии классического размера бурого жировика.
Он также может быть применен для изучения процесса потемнения белых адипоцитов. Продемонстрировать процедуру будет Аманда, научный сотрудник из моей лаборатории. Начните с размещения колбы с BAT и раствором для пищеварения на магнитной мешалке со скоростью 60 оборотов в минуту в инкубаторе с температурой 35 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Используйте одну миллилитровую пипетку, чтобы разрушить агрегированные сгустки тканей ломтиков BAT вокруг бара мешалки. После пищеварения поместите 70-микрометровый фильтр сетчатого фильтра поверх чистой 50-миллилитровой центрифужной трубки и пипетки вокруг четырех миллилитров клеточной суспензии через ситечко. Затем промыть его четырьмя миллилитрами 12% раствора йодиксанола.
Пипетка вверх и вниз, чтобы смешать клетки с раствором йодиксанола, затем перенести клеточную смесь в две прозрачные пробирки из полистирола пять миллилитров. Поместите полистирольные трубки, содержащие смесь ячеек, на лед в течение одного часа, в результате чего БА образуют слой сверху. Выньте 20 микролитров изолированных БА для исследования в микроскоп.
Для выделения РНК и белка пипетка слоя БА в две 1,7-миллилитровые микроцентровые трубки. Затем осторожно удаляют избыточный раствор йодиксонала, не нарушая слой БА. Затем добавьте один миллилитр TRIzol в клеточный раствор, чтобы одновременно выделить РНК, ДНК и белок и смешать достаточно, чтобы щелкнуть клетки.
Чтобы разделить фазы, добавьте 200 микролитров хлороформа и центрифуги в трубку при 9, 981 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования используют водную фазу для выделения РНК. Переложите 300 микролитров органической фазы в двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку и добавьте 750 микролитров 100% этанола.
После вихря в течение 10 секунд добавьте 200 микролитров 1-бром-3-хлорпропана и снова вихрь в течение 10 секунд. Добавьте 600 микролитров двойной дистиллированной воды перед вихрем в течение 10 секунд. Дайте смешанному раствору постоять 10 минут при комнатной температуре.
После центрифугирования добавляют 9 981 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Фазы будут разделены белковой фазой, локализованной в среднем слое. Удалите верхний водный раствор и добавьте один миллилитр 100% этанола в оставшийся раствор.
После центрифугирования при 9, 981 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия отбросьте надосадочное вещество и промыть гранулу одним миллилитром 100% этанола. Центрифуга при 9, 981 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После удаления супернатанта высушите гранулу на воздухе в течение 10 минут при комнатной температуре и измерьте вес влажной гранулы.
Добавьте 1% раствор SDS в соотношении 20 микролитров на миллиграмм гранулы. Растворите гранулу полностью, поместив трубку в нагретый шейкер при 55 градусах Цельсия и 11 г в течение пяти-10 минут. В протоколе PBS, содержащий 3% BSA, использовался для отделения BA от BAT.
Изолированные клетки имели малиновую форму с мультилокулярными липидными каплями внутри и были tdTom положительными, подтверждая, что они были BA. Белок был выделен из БА с улучшенным протоколом GTPC, а затем исследован гелем SDS-PAGE. Доминирующая полоса, связанная с BSA, наблюдалась в образце BA, что свидетельствует о его вмешательстве в экстракцию белка.
Чтобы избежать интерференции BSA, для выделения БА использовался 6%-йодиксональный раствор, который имел типичную малиновую форму и содержал многочелюстные липидные капли. Белки, извлеченные из этих БА, были хорошо разделены в геле SDS-PAGE. Было обнаружено, что эти клетки являются tdTomato положительными, тогда как клетки, извлеченные из гранулы, были tdTomato отрицательными без явных липидных капель, что предполагает эффективное отделение BA от нежировых клеток.
При анализе экспрессии генов уровни мРНК UCP1 и PDGFA были значительно выше в изолированных БА. Но мРНК PDGFRA была обнаружена только в BAT. Белок UCP1 был обнаружен обогащенным изолированными БА.
ЭдГФР альфа была обнаружена в BAT, но не в изолированных БА. Эти результаты подтверждают эффективность метода выделения БА и демонстрируют, что выделенные БА подходят для исследований экспрессии генов и белков. При попытке этого протокола используйте свежий буфер пищеварения, чтобы диссоциировать коричневую жировую ткань и избежать образования тканевого комка в период пищеварения.
Этот новый метод позволяет легко исследовать биологию коричневой жировой ткани на уровне одной клетки. Применяя этот метод, можно выполнять исследования GN и экспрессии белка с чистыми коричневыми адипоцитами, точно рассекающими программу экспрессии генов коричневых адипоцитов, не беспокоясь о загрязнении первоначально из обезжиренных клеток.
