Первичные преадипоциты являются ценной экспериментальной системой для понимания молекулярных путей, которые контролируют метаболизм адипоцитов. Куриные эмбрионы дают возможность выделить преадипоциты с самой ранней стадии развития адипоцитов. Этот метод был оптимизирован для получения клеток с высокой жизнеспособностью и повышенной способностью дифференцироваться в зрелые адипоциты, которые могут быть использованы для функционального анализа роста жира в раннем возрасте и развития эмбриона у цыплят.
Процесс адипогенной дифференциации очень сопоставим между курами и людьми. Поэтому изолированные преадипоциты могут быть использованы в качестве модели с двойным предложением для исследований, относящихся к людям и домашней птице. Начать смазывание тела эмбриона 70% этанолом.
Затем для предотвращения помех при фильтрации на более поздних этапах после пищеварения аккуратно очищают поверхность кожи стерильной марлей для удаления перьев. Затем срежьте кожу между ногами и брюшной областью, чтобы выявить пару бедренных жировых депо. Используйте изогнутые щипцы одной рукой, чтобы держать кожу вокруг ноги и аккуратно удалить бедренный подкожный жир.
с другой стороны. Позже используйте изогнутые щипцы, чтобы осторожно оттянуть депо от ноги. Переложите ткани в 15-миллилитровую трубку, содержащую пять миллилитров коллекционной среды, и повторите рассечение для другой стороны жировой подушки.
Теперь переложите собранные жировые подушечки в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую стерилизационный раствор, и ненадолго промойте, закрутив блюдо несколько раз. Затем промыть стерилизационный раствор, перенеся жировые прокладки в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую PBS. Аккуратно закрутите тарелку и еще раз вымойте PBS.
Для переваривания жировых тканей переложите их в 15-миллиметровую трубку, содержащую предварительно теплый ферментативный раствор. Затем погрузите пару длинных прямых ножниц в трубку и, наконец, измельчите жировые ткани в растворе на кусочки как можно меньше. Переложите измельченную ткань и ферментативный раствор в 25-миллилитровую автоклавную колбу.
Оберните колбу парафиновой пленкой и поместите колбу в орбитальный шейкер-инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия для пищеварения. После переваривания аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать. Затем удалите любые кусочки непереваренной ткани и мусора, фильтруя через 250-микрометровый тканевой сетчатый фильтр в 15-миллилитровую трубку путем пипетирования.
Теперь удалите клетки, прилипшие к колбе, промыв колбу четырьмя миллилитрами питательной среды и отфильтруйте клеточную суспензию в ту же 15-миллилитровую трубку. Затем промыть ситечко, снова пипетировав питательную среду, чтобы удалить все клетки, захваченные в фильтре. Центрифугу в 300 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре гранулируют клеточную фракцию и аспирируют супернатант, не нарушая ячейку гранулы.
Осторожно повторно суспендировать гранулу в одном миллилитре буфера лизиса эритроцитов, хорошо перемешать путем пипетки и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем разбавляют клетки, добавляя пять миллилитров питательной среды в трубку, содержащую клетки, и мягко перемешивают их путем пипетирования. Теперь пипетка клеток на 40-микрометровый клеточный сетчатый фильтр и фильтруйте их в новую 50-миллилитровую трубку.
Затем промыть ситечко дополнительными пятью миллилитрами питательной среды и гранулировать клетки центрифугированием в 300 раз G в течение семи минут при комнатной температуре. Осторожно аспирируйте супернатант. Повторное суспендирование оставшейся клеточной гранулы в одном миллилитре питательной среды путем пипетирования Для определения плотности и жизнеспособности клеток смешайте 10 микролитров каждого образца в трипан-синем путем пипетирования.
Загрузите 10 микролитров смеси на гемоцитометр и подсчитайте клетки. Анализ преадипоцитов через 24, 48 и 72 часа показал нормальную морфологию и количество клеток. Адипогенная индукция преадипоцитов показала быструю дифференцировку и накопление липидных капель.
Агрессивное обращение с преадипоцитами во время изоляции приводило к повреждению клеток и низкому количеству клеток. Микробное загрязнение может наблюдаться, несмотря на принятие профилактических мер. Окрашивание липидов маслом красного O указывает на то, что преадипоциты быстро начинают вырабатывать липидные капли под адипогенным индуцированием и накопление прогрессирует с течением времени, как это наблюдалось через 24, 48 и 72 часа.
Накопление липидов относительно числа клеток количественно оценивали с использованием липидных и ДНК-пятен. Как накопление липидов, так и пролиферация клеток увеличивались с течением времени. Низкое количество клеток или поврежденные клетки могут наблюдаться, когда тканевые фракции перевариваются слишком долго.
Поэтому рекомендуется не превышать полтора часа пищеварения. Изолированные преадипоциты могут быть использованы для исследований экспрессии генов. Достаточное количество РНК может быть получено для использования в синтезе кДНК и последующем qPCR или RNAseq.
