Это первый протокол, который позволяет поддерживать ткань молочной железы человека живой ex vivo в течение длительных периодов времени, что непосредственно позволяет изучать взаимодействия между тканью молочной железы человека и раком молочной железы человека. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет поддерживать макроскопические участки ткани молочной железы человека, включая адипоциты молочной железы, иммунные клетки, сосудистые структуры, проточные структуры и внеклеточный матрикс, поддерживать жизнь ex vivo. Этот метод имеет серьезные последствия для нескольких областей исследований рака молочной железы, включая персонализированную медицину, фармацевтические разработки и патофизиологию инициации опухоли и более медленные процессы рака молочной железы, такие как фиброз и ремоделирование внеклеточного матрикса.
Эту процедуру демонстрируют Кэтрин Хеберт, аспирантка Тулейна, и Ракеш Гуррала, студент-медик из Тулана из моей лаборатории. Для начала расплавите приготовленный желатиновый раствор на водяной бане 37 градусов Цельсия. Используйте пяти- или 10-миллилитровую серологическую пипетку, чтобы дозировать 2,5 миллилитра этого раствора на каждый плунжер для колодцев из шести скважинной пластины.
Как только желатин затвердеет, переместите пластины ASC с кодом pNIPAAm в шкаф биобезопасности. Аккуратно поместите плунжеры в колодцы этих пластин так, чтобы желатин контактирует с ИСС. Поместите металлическую шайбу на поршень, чтобы утяжелеть его так, чтобы желатин находился в непосредственном контакте с листом ASC в течение 30 минут при комнатной температуре.
Осторожно переместите пластину с плунжерами в стерильную коробку в шкафу биобезопасности и поместите на нее крышку. Переместите коробку в четырехградульный холодильник или поместите тарелку на лед и ведро со льдом в шкаф биобезопасности на 30 минут. В шкафу биологической безопасности трижды промыть ткань молочной железы человека 10 миллилитрами стерильного PBS.
Используйте стерильные щипцы и лезвие бритвы, чтобы грубо измерзть BC-MPS и попытаться удалить как можно больше фасций и соединительной ткани. После того, как соединительная ткань была удалена, используйте стерильное лезвие бритвы, чтобы окончательно измертить ткань, пока она не обреаст однородную жидкую консистенцию. Вырежьте наконечник пипетки P1000, чтобы помочь в пипетке измельченной ткани.
В трубке размером 1,5 миллилитра соедините ткань фарса, линии раковых клеток и ткани BC-MPS, как описано в текстовой рукописи. Переместите пластину ACS, которая будет использоваться для нижнего листа ячейки, из инкубатора в шкаф биобезопасности и аспирировать жимы с пластины. Пипетку приготовленной смеси тканей молочной железы на центр колодца нижней пластины ACS с помощью разрезанного наконечника пипетки, переместите коробку, содержащую верхнюю пластину ACS с плунжерами, в шкаф биобезопасности.
Аккуратно удалите желатиновые плунжеры с пластины, покрытой pNIPAAm, и поместите их поверх смеси тканей. Добавьте в скважину носитель BC-MPS и аккуратно переместите нижние пластины ACS со смесью BC-MPS и плунжерами в стерильную пластиковую коробку. Поместите крышку коробки для транспортировки, заботясь о том, чтобы избежать загрязнения культуры.
Инкубировать нижнюю пластину в коробке и инкубаторе при температуре 37 градусов цельсия до тех пор, пока желатин не расплавится и верхний слой ACS не начнет прилипать к нижнему слою. Затем переместите коробку с пластинами в шкаф биобезопасности, аккуратно снимите плунжеры с нижних пластин, чтобы наблюдать за тканью с раковыми клетками, закрепленными на дне колодца. Поместите крышку шестиствольной пластины обратно на нижнюю пластину и инкубировать при 37 градусах, чтобы полностью расплавить желатин и позволить верхнему слою закрепиться на нижнем слое.
Аккуратно переместите пластины в биобезопасный шкаф и аспирируйте жимы с края лунки серологической пипеткой 10 миллилитров. Добавьте два миллилитра свежей среды на край каждого колодца, чтобы избежать смещения ткани. Поддерживайте BC-MPS на уровне 37 градусов по Цельсию и 5% углекислого газа в течение желаемого периода времени.
Смена носителя каждые два-три дня. Переместите пластину в шкаф биобезопасности, когда BC-MPS будет готов к анализу. Удалите жижи серологической пипеткой, чтобы избежать случайного смещения любой ткани.
Добавьте один том PBS в каждую скважину. Затем удалите PBS серологической пипеткой. Добавьте один миллилитр раствора диссоциации клеток в каждую лунку и переместите пластину обратно в инкубатор на пять минут, чтобы позволить этим клеткам отсоединиться.
После инкубации используйте клеточный скребок, чтобы полностью отсоеродить клетки и ткани от культуральная пластина в шкафу биобезопасности. Переложите раствор с тканью в коническую трубку 15 миллилитров и соберите оставшиеся клетки, добавив два миллилитра PBS. Оберните трубку алюминиевой фольгой, если ячейки флуоресцентные.
Инкубируют трубку при 37 градусах при постоянном перемешивании в орбитальном шейкере в один раз G в течение 10-20 минут, чтобы полностью диссоциировать клетки из ткани. В шкафу биобезопасности используйте серологическую пипетку, чтобы разрушить любые оставшиеся скопления клеток в трубке. И отфильтруйте образец через 250-микрометровый тканевой ситечко в новую 15-миллилитровую трубку.
Промыть ситечко одним миллилитром PBS, чтобы собрать оставшиеся клетки. Центрифугирование образцов в 500 раз при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы отделить адипоциты, которые будут плавать в верхнем слое, от раковых клеток и ИСС, смешанных вместе в грануле. Перенесите слой адипоцитов в новую трубку с помощью тупого разреза наконечника пипетки.
Снова центрифугируйте образец и используйте шприц и иглу, чтобы удалить оставшийся раствор из-под адипоцитов. Аспирировать оставшийся раствор из трубки, содержащей ИСК и раковые клетки, не нарушая клеточную гранулу. Повторно приостановите гранулу в среде PBS или BC-MPS и используйте проточную цитометрию для сортировки клеток на основе флуоресценции.
Здесь показан рисунок слиюного листа ASC. Плавучая ткань молочной железы человека все еще была стабильно закреплена листами клеток ASC на дне колодца после 14 дней культивирование. Флуоресцентные микроскопические изображения демонстрируют стабильность BC-MPS с MDA-MB-231, экспрессирующими клеточные линии RFP через 14 дней и с тройной отрицательной опухолью эксплант pdx в течение не менее шести дней.
BC-MPS, содержащий ткань молочной железы, культивировали in vitro в течение 14 дней, окрашивали и изобразили, чтобы продемонстрировать нативные элементы ткани при 100X и 20X увеличении. Окрашивание маркеров макрофагов использовалось для демонстрации сохранения первичных макрофагов после трех и семи дней в культуре. Анализ проточной цитометрии окрашенных Бодипи MDA-MB-231 клеток через 14 дней указывает на минимальное накопление липидов в 2D-культуре и обширное накопление липидов и BC-MPS.
Доля липид-положительных клеток MDA-MB-231 была в 26,2 раза больше в BC-MPS, чем в 2D-культуре. Клетки, культивируемые в BC-MPS, показали увеличение липидных капель по сравнению с клетками, культивируемыми в стандартной 2D-культуре. Покадровые изображения RFP,помеченных BC-MPS с клетками MDA-MB-231, показали амебоидное движение 231 клетки с псевдоподами и высокой подвижностью.
Ткань молочной железы должна быть измельчена достаточно мелко и отделена достаточно, чтобы ее можно было распределить по дну колодца. Ткань молочной железы очень плавучая, и если кусочки слишком велики или сгруппированы слишком близко друг к другу, листы клеток ASC не смогут закрепить ткань молочной железы на дне колодца. Полученные конструкции рака молочной железы могут подвергаться ферментативному пищеварению для выделения определенных типов клеток, представляющих интерес.
Это позволит ответить на ключевые вопросы, такие как то, как раковые клетки в ткани молочной железы по-разному реагируют на химиотерапию по сравнению с традиционной 2D-культурой или органоидами.
