Трудно оценить функцию саркомера в кардиомиоцитах, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, из-за их недоразвитого и дезорганизованного саркомера. Используя флуоресцентные белки саркомера, мы теперь можем получить доступ к укорочению саркомера. Мы можем визуализировать саркомеры и оценить их функцию in vitro, используя кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток, и флуоресцентные белки саркомера.
Используя трансдукцию на основе AAV, мы можем расширить метод на любые индуцированные пациентом плюрипотентные стволовые клетки. Этот метод может быть расширен до развития терапии кардиомиопатии, так как он может быть использован для непосредственной оценки связанной с заболеванием саркомерной дисфункции in vitro. Этот метод полезен в области кардиологии, в том числе в педиатрической кардиологии.
Тем не менее, он также может быть применен для изучения дисфункции скелетных мышц, такой как миопатия. На день минус четвертый индукции дифференцировки покрывают шестиямямную пластину 0,5 мкг на квадратный сантиметр ламинина-511 Е8, разбавленным в PBS для 30-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Ближе к концу инкубации обработайте индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки рекомбинантным трипсином в течение трех минут при 37 градусах Цельсия.
Когда клетки отделились, собирают клетки в среду, дополненную 10% FBS для подсчета, и повторно суспендировали клетки в 1,25 раза 10 к пятой клетке на два миллилитра среды AK02N, дополненной ламинином-511 E8 и ингибитором ROCK после центрифугирования. Затем аспирируют раствор покрытия из каждой лунки шестискубочной пластины и засевают два миллилитра клеток в каждую лунку. Верните пластину в инкубатор клеточной культуры.
Через четыре дня клетки достигают 80% слияния. Замените супернатант в каждой лунке двумя миллилитрами RPMI плюс B27 без инсулиновой среды, дополненной ингибитором GSK-3 на лунку, чтобы индуцировать дифференцировку. После двух дней дифференцировки осторожно заменить среду двумя миллилитрами RPMI плюс B27 без инсулиновой среды, дополненной ингибитором дикобраза на лунку.
Клетки должны были достичь 100% слияния. На четвертый день дифференцировки осторожно замените супернатанты двумя миллилитрами RPMI плюс B27 без инсулина на лунку. Клетки должны оставаться на высокой плотности, и некоторые, возможно, начали плавать.
На седьмой и девятый день дифференцировки замените супернатант в каждой лунке двумя миллилитрами RPMI плюс B27 инсулином, дополненным пуромицином для селективной культуры кардиомиоцитов, полученной из плюрипотентных стволовых клеток. В этот момент в культурах следует наблюдать биение клеток. Чтобы создать узорчатую культуру кардиомиоцитов, полученную из плюрипотентных стволовых клеток, сначала используйте восстанавливающую ленту для удаления любой пыли с поверхности изготовленного на заказ штампа PDMS и ненадолго погружайте штамп в 70% этанол.
Используйте воздушный пылесос для удаления этанола с поверхности штампа и обработайте поверхность от пяти до 10 микролитров 0,5% MPC полимера и этанола. Когда полимер полностью высохнет, поместите штамп на полимерную крышку в 35-миллиметровую тарелку для визуализации и поместите вес на штамп. Через 10 минут используйте световой микроскоп, чтобы подтвердить, что рисунок был перенесен на крышку, и вымойте посуду и крышку два раза с PBS.
После второй стирки покрывайте крышку от 0,5 до одного микрограмма на квадратный сантиметр ламинина-511 Е8, разведенного в 0,1% желатина для двух-четырехчасовой инкубации при комнатной температуре. На 10 день дифференцировки промыть клетки два раза PBS с последующим лечением одним миллилитром рекомбинантного трипсина на лунку в течение трех-пяти минут при 37 градусах Цельсия. После подсчета повторно суспендировать клетки в 2,5-пять раз от 10 до пятой клетки на миллилитр RPMI плюс B27 инсулином, дополненным концентрацией пуромицина, и посеять один миллилитр клеток на пластину для ночной инкубации при 37 градусах Цельсия.
На следующее утро замените супернатант свежим RPMI плюс B27 инсулином, дополненным пуромицином, и верните клетки в инкубатор клеточной культуры, обновляя среду два-три раза в неделю до 21-28 дней для визуализации. Для покадровой визуализации укорочения саркомера в культурах PCCSM нанесите масло на объектив люминесцентного конфокального микроскопа в 100 раз и выберите условия визуализации в реальном времени в соответствующем программном обеспечении. Чтобы получить хорошие репрезентативные данные, выберите самую высокую частоту кадров, установите затвор на открытие и примените биннинг четыре на четыре в обрезке области сбора, чтобы достичь кратчайших интервалов между изображениями во время покадровой съемки.
Если скорость биения клеток низкая, вызвате клетки с помощью стимуляции электрическим полем и начните покадровую запись, заботясь о том, чтобы изображенное поле оставалось в фокусе во время визуализации. В конце периода обработки изображений сохраните покадровые изображения в соответствующую папку. Чтобы проанализировать покадровые изображения, откройте серию покадровых изображений в ImageJ и отрегулируйте яркость и контрастность изображений до тех пор, пока не будет четко наблюдаться саркомерная картина.
В меню Дополнительные инструменты выберите SarcOptiM и нажмите клавишу Control Shift P и кнопку в один микрон на панели инструментов, чтобы использовать инструкции по калибровке программы. Затем проведите линию через область саркомера, которая будет использоваться для измерения укорочения саркомера, и нажмите Single Cell AVI, чтобы начать анализ укорочения саркомера. Покадровая визуализация меченых саркомером, узорчатых кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, может быть использована для измерения укорочения саркомера в разные моменты времени.
Чтобы преодолеть саркомерную дезорганизацию, обычно наблюдаемую в паттерновых культурах кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, специфические штампы PDMS могут быть использованы для культивации кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, в полосатом рисунке, который способствует удлиненной форме клеток и более организованному саркомерному паттерну по сравнению с клетками, культивируемыми в нешабличной области. Узорчатые культуры также способствуют лучшему сокращению клеток и обеспечивают гладкий профиль длины саркомера по сравнению с невывиженными культивируемыми клетками. AAV-трансдуцированные паттернные плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток, экспрессируют саркомерные сигналы GFP вдоль узорчатых кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, уже через три дня после трансдукции, а также могут быть использованы для измерения профилей сокращения саркомера.
Кроме того, добавление гена, резистентного к бластицидину, во время трансдукции также может быть использовано для облегчения узорчатого отбора кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, до чистоты более 90% Чтобы облегчить более легкий и качественный анализ изображения, важно идентифицировать область с саркомерами, которые движутся линейно, и получить изображения с самой высокой частотой кадров. Используя этот метод, мы можем оценить роль созревания в белках саркомы для изучения саркомеровой дисфункции в лабораторных кардиомиоцитах, полученных из специфических для заболевания iPS-клеток, полученных от пациента.
