Es difícil evaluar la función del sarcómero en los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes debido a su sarcómero subdesarrollado y desorganizado. Usando proteínas de sarcómero marcadas con fluorescentes, ahora podemos acceder al acortamiento de sarcómero. Podemos visualizar sarcómeros y evaluar su función in vitro utilizando cardiomiocitos derivados de células madre y proteínas de sarcómero marcadas con fluorescentes.
Utilizando la transducción basada en AAV, podemos ampliar el método a cualquier célula madre pluripotente inducida derivada del paciente. Este método se puede ampliar al desarrollo de la terapia de la cardiomiopatía, pues se puede utilizar para evaluar directamente la disfunción enfermedad-relacionada del sarcómero in vitro. Este método es útil en el campo de la cardiología, incluyendo el estudio de cardiología pediátrica.
Sin embargo, también se puede aplicar al estudio de la disfunción del músculo esquelético, como la miopatía. En el día menos cuatro de inducción de diferenciación, cubra una placa de seis pozos con 0,5 microgramos por centímetro cuadrado de laminina-511 E8 diluida en PBS para una incubación de 30 minutos a 37 grados centígrados y dióxido de carbono al 5%. Acercándose al final de la incubación, trate las células madre pluripotentes inducidas por el hombre con tripsina recombinante durante tres minutos a 37 grados Centígrados.
Cuando las células se han separado, cosechar las células al medio suplementado con 10% FBS para el conteo, y resuspend las células en un 1,25 veces 10 a las quintas células por dos mililitros de ak02n medio complementado con laminin-511 E8 y el inhibidor de rock después de la centrifugación. A continuación, aspire la solución de recubrimiento de cada pozo de la placa de seis pozos y sembra dos mililitros de células en cada pozo. Devuelva la placa a la incubadora de cultivos celulares.
Después de cuatro días, las células alcanzan el 80% de confluencia. Substituya el sobrenadante en cada pozo con dos mililitros de RPMI más B27 sin medio de insulina suplementado con el inhibidor de GSK-3 por pozo para inducir la diferenciación. Después de dos días de diferenciación, reemplace suavemente el medio con dos mililitros de RPMI más B27 sin medio de insulina complementado con inhibidor de puercoespín por pozo.
Las células deberían haber alcanzado el 100% de confluencia. En el cuarto día de diferenciación, reemplace suavemente los sobrenadantes con dos mililitros de RPMI más B27 sin insulina por pozo. Las células deben permanecer en una alta densidad, y algunas pueden haber comenzado a flotar.
En el día siete y nueve de diferenciación, reemplace el sobrenadante en cada pozo con dos mililitros de RPMI más B27 con insulina suplementada con puromicina para el cultivo selectivo de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes. En este punto, las células batientes deben observarse dentro de los cultivos. Para establecer un cultivo de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes estampadas, primero use cinta de rematada para eliminar cualquier polvo de la superficie de un sello PDMS hecho a medida, y sumerja brevemente el sello en etanol al 70%.
Use un plumero de aire para eliminar el etanol de la superficie del sello y trate la superficie con cinco a 10 microlitros de polímero y etanol al 0,5% MPC. Cuando el polímero se haya secado por completo, coloque el sello en una cubierta de polímero en un plato de imágenes de 35 milímetros y coloque un peso en el sello. Después de 10 minutos, use un microscopio de luz para confirmar que el patrón se ha transferido al cubrebocas, y lave el plato y el cubrebocas dos veces con PBS.
Después del segundo lavado, cubra el cubrebocas con 0,5 a un microgramo por centímetro cuadrado de laminina-511 E8 diluido en gelatina al 0,1% para una incubación de dos a cuatro horas a temperatura ambiente. En el día 10 de diferenciación, lave las células dos veces con PBS, seguido de un tratamiento con un mililitro de tripsina recombinante por pocillo durante tres a cinco minutos a 37 grados centígrados. Después de contar, resuspend las células en un 2,5 a cinco veces 10 a las quintas células por mililitro de RPMI más B27 con insulina complementada con la concentración de puromycin, y la semilla de un mililitro de células en la placa para una incubación de noche en 37 grados centígrados.
A la mañana siguiente, reemplace el sobrenadante con RPMI fresco más B27 con insulina suplementada con puromicina, y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular, refrescando el medio dos o tres veces por semana hasta los días 21 a 28 para obtener imágenes. Para obtener imágenes de lapso de tiempo del acortamiento de sarcómeros en los cultivos de PCCSM, aplique aceite a la lente objetivo de 100 veces de un microscopio confocal fluorescente y seleccione las condiciones de imagen en vivo en el software asociado. Para obtener buenos datos representativos, seleccione la velocidad de fotogramas más alta, ajuste el obturador para que se abra y aplique una agrupación de cuatro por cuatro en un recorte del área de adquisición para lograr los intervalos más cortos entre las imágenes durante la proyección de imagen de lapso de tiempo.
Si la tasa de batimiento de las células es baja, evocar las células mediante estimulación de campo eléctrico, y comenzar la grabación de lapso de tiempo, teniendo cuidado de que el campo de la imagen permanece en foco durante la proyección de imagen. Al final del período de creación de imágenes, guarde las imágenes de lapso de tiempo en una carpeta adecuada. Para analizar las imágenes de lapso de tiempo, abra una serie de imágenes de lapso de tiempo en ImageJ y ajuste el brillo y el contraste de las imágenes hasta que se pueda observar claramente el patrón de sarcómero.
En el menú Más herramientas, seleccione SarcOptiM y pulse Control Shift P y el botón de una micras de la barra de herramientas para utilizar las instrucciones para calibrar el programa. A continuación, dibuje una línea a través de la región del sarcómero que se utilizará para medir el acortamiento del sarcómero y haga clic en AVI de una sola celda para comenzar el análisis de acortamiento del sarcómero. Las imágenes de lapso de tiempo de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes etiquetadas con sarcómero y con patrón se pueden utilizar para medir el acortamiento del sarcómero en diferentes puntos de tiempo.
Para superar la desorganización del sarcómero típicamente observada en cultivos de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes con patrones, se pueden usar sellos pdms específicos para cultivar cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes con patrones en un patrón de rayas, que promueve una forma de célula alargada y un patrón de sarcómero más organizado en comparación con las células cultivadas en un área no patrón. Los cultivos modelados también promueven una mejor contracción celular y proporcionan un perfil de longitud de sarcómero suave en comparación con las células cultivadas sin patrón. AAV-transduced patrón pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes express sarcomeric GFP signals along the patterned pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as early as three days post-transduction and can also be used to measure sarcomere contraction profiles.
Además, la adición de un gen resistente a la blasticidina durante la transducción también se puede utilizar para facilitar la selección de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes con una pureza de más del 90% Para facilitar un análisis de imágenes más fácil y de mayor calidad, es esencial identificar un área con sarcómeros que se muevan linealmente y obtener imágenes a la velocidad de fotogramas más alta. Usando este método, podemos evaluar el papel de la maduración en proteínas del sarcoma para estudiar la disfunción del sarcómero en el cardiomyocyte del laboratorio derivado de las células enfermedad-específicas, paciente-derivadas del iPS.
