다능성 줄기 세포 유래 심근세포에서 sarcomere 기능을 평가하기는 어렵습니다. 형광 태그 사커레 단백질을 사용하여, 우리는 지금 sarcomere 단축에 접근할 수 있습니다. 우리는 sarcomeres를 시각화하고 줄기 세포 유래 심근세포및 형광 태그 sarcomere 단백질을 사용하여 체외에서 그들의 기능을 평가할 수 있습니다.
AAV 기반 트랜스듀션을 사용하여, 당사는 모든 환자 유래 유도 만능 줄기 세포로 방법을 확장할 수 있습니다. 이 방법은 체외에서 질병 관련 사코메레 기능 장애를 직접 평가하는 데 사용될 수 있기 때문에 심근병증 치료의 발달로 확장될 수 있다. 이 방법은 소아 심장학 연구를 포함하여 심장학 분야에서 유용합니다.
그러나, 그것은 또한 골격 근육 기능 장애의 연구에 적용 될 수 있습니다., 근 병 증 등. 차별화 유도의 마이너스 4일에, 37섭씨 와 5%의 이산화탄소에서 30분 배양에 PBS에서 희석된 라미닌-511 E8의 평방 센티미터 당 0.5 마이크로그램으로 6웰 플레이트를 코팅합니다. 인큐베이션의 끝에 가까워지면, 37°C에서 3분 동안 재조합 트립신으로 인간이 유발한 만능 줄기 세포를 치료한다.
세포가 분리되면, 카운트에 대한 10%FBS로 보충된 배지에 세포를 수확하고, 원심 분리 후 라미닌-511 E8 및 ROCK 억제제로 보충된 AK02N 배지의 2밀리리터 당 5세포에 1.25배 10배로 세포를 재연한다. 다음으로, 6웰 플레이트의 각 웰에서 코팅 용액을 흡인시키고, 각 우물에 2밀리리터의 세포를 시드한다. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.
4 일 후에, 세포는 80%의 합류에 도달합니다. 각 웰의 상체를 GSK-3 억제제로 보충한 인슐린 배지 없이 RPMI 플러스 B27의 2밀리리터로 대체하여 분화를 유도한다. 분화 2 일 후, 부드럽게 잘 당 포큐파인 억제제로 보충 인슐린 매체없이 RPMI 플러스 B27의 2 밀리리터로 배지를 교체.
세포는 100%의 합류에 도달했어야 합니다. 차별화의 4 일째에, 부드럽게 잘 당 인슐린없이 RPMI 플러스 B27의 두 밀리리터로 슈퍼 네이션을 교체. 세포는 고밀도로 남아 있어야 하며 일부는 떠다니기 시작했을 수 있습니다.
7일째와 9일째에, 선택적 만능 줄기 세포 유래 심근세포 배양을 위해 푸오마이신으로 보충된 인슐린으로 RPMI 플러스 B27의 2밀리리터와 각각의 상체를 대체한다. 이 시점에서, 구타 세포는 배양 내에서 관찰되어야한다. 패턴만능 줄기 세포 유래 심근세포 배양을 설정하려면 먼저 수선 테이프를 사용하여 맞춤형 PDMS 스탬프의 표면에서 먼지를 제거하고 70%에 이르는 스탬프를 잠깐 잠정적으로 잠급니다.
에어 더스터를 사용하여 우표 표면에서 에탄올을 제거하고 표면을 0.5% MPC 폴리머 및 에탄올의 5~10마이크로리터로 처리합니다. 폴리머가 완전히 건조되면 35mm 이미징 접시에 폴리머 커버슬립에 스탬프를 놓고 스탬프에 무게를 놓습니다. 10분 후, 가벼운 현미경을 사용하여 패턴이 커버슬립으로 옮겨졌는지 확인하고 PBS로 접시와 커버슬립을 두 번 세척합니다.
두 번째 세척 후, 커버슬립을 실온에서 2~4시간 배양하기 위해 0.1%젤라틴으로 희석된 라미닌-511 E8의 평방 센티미터당 0.5~1마이크로그램으로 코팅합니다. 분화의 10 일째에, PBS로 세포를 두 번 씻고, 섭씨 37도에서 3 5 분 동안 잘 재조합 트립신 1 밀리리터로 치료합니다. 계산 후, RPMI의 밀리리터 당 5 세포에 2.5 ~ 5 배 10에 세포를 다시 일시 중단하고, 푸오 마이신 농도로 보충 인슐린과 B27, 37 섭씨에서 하룻밤 배양에 대한 접시에 세포의 1 밀리리터를 종자.
다음 날 아침, 상체를 신선한 RPMI 플러스 B27로 대체하여 푸오마이신으로 보충된 인슐린으로 대체하고, 세포를 세포 배양 인큐베이터로 돌려보내, 이미징을 위해 21일에서 28일까지 일주일에 2~3회 중간을 상쾌하게 한다. PCCSM 배양에서 sarcomere 단축의 시간 경과 화상 진찰을 위해, 형광 공초점 현미경의 100 배 객관적인 렌즈에 기름을 적용하고, 관련 소프트웨어에서 살아있는 화상 진찰 조건을 선택합니다. 좋은 대표 데이터를 얻으려면 가장 높은 프레임 속도를 선택하고 셔터를 열어 놓고 획득 영역의 작물에 4x4 비닝을 적용하여 시간 경과 이미징 중에 이미지 간의 최단 간격을 달성합니다.
세포의 구타 속도가 낮으면 전기장 자극에 의해 세포를 연상시키고 시간 경과 기록을 시작하여 이미징 중에 이미지 필드가 초점상태로 남아 있음을 주의하십시오. 이미징 기간이 끝나면 시간 경과 이미지를 적절한 폴더에 저장합니다. 시간 경과 이미지를 분석하려면 일련의 타임랩스 이미지를 ImageJ로 열고 사커머 패턴을 명확하게 관찰 할 때까지 이미지의 밝기와 대비를 조정합니다.
모어 도구 메뉴에서 SarcOptiM을 선택하고 도구 모음의 컨트롤 시프트 P와 하나의 미크론 버튼을 눌러 프로그램을 보정하는 지침을 사용합니다. 그런 다음 sarcomere 단축을 측정하는 데 사용할 사컴레 의 영역에 걸쳐 선을 그리고 단일 셀 AVI를 클릭하여 사컴레 단축 분석을 시작합니다. 사코프레 라벨, 패턴만능 줄기 세포 유래 심근세포의 시간 경과 이미징은 상이한 시점에서 sarcomere 단축을 측정하는 데 사용될 수 있다.
패턴형 다능줄기 세포 유래 심근세포 배양에서 전형적으로 관찰되는 사코메르 해체를 극복하기 위해, 특정 PDMS 우표는 패턴화된 다능성 줄기 세포 유래 심근세포를 스트라이프 패턴으로 배양하는 데 사용될 수 있으며, 이는 비패턴 영역에서 배양된 세포 에 비해 길쭉한 세포 모양과 보다 조직화된 사림귀 패턴을 촉진한다. 패턴 배양은 또한 더 나은 세포 수축을 촉진하고 비 패턴 배양 세포에 비해 매끄러운 sarcomere 길이 프로파일을 제공합니다. AAV-변환 패턴 만능 줄기 세포 유래 심근세포는 3일 후 트랜스듀션 후 패턴만능 줄기 세포 유래 심근세포를 따라 육종 GFP 신호를 발현하고 또한 사코메 수축 프로파일을 측정하는 데 사용될 수 있다.
또한, 트랜스듀션 시 블라실시딘 내성 유전자를 첨가하여 패턴형 다능성 줄기 세포 유래 심근세포 선택을 90% 이상의 순도로 용이하게 하기 위해 보다 쉽고 높은 품질의 이미지 분석을 용이하게 하기 위해서는, 선형으로 이동되는 사르코메어를 가진 영역을 식별하고 가장 높은 프레임 속도로 이미지를 얻는 것이 필수적이다. 이 방법을 사용하여, 우리는 질병 특정, 환자 유래 iPS 세포에서 파생된 실험실 심근세포에 있는 sarcomere 기능 장애를 연구하기 위하여 육종 단백질에 있는 성숙의 역할을 평가할 수 있습니다.
