Наклон ступени образца обеспечивает простой и обобщаемый способ увеличения распределения ориентации частиц при сборе одночастичных крио-ЭМ-данных. Равномерное распределение частиц, полученное за счет наклона ступени образца, позволяет улучшить общее качество карты и интерпретируемость. Начните с выравнивания микроскопа, чтобы обеспечить параллельное освещение образца и свести к минимуму аберрации комы.
Чтобы определить квадраты, пригодные для сбора данных, запишите атлас сетки без наклона сцены или с наклоном сцены, который дает общее представление об общем качестве сетки и первоначальное указание подходящих областей для сбора данных. Осмотрите квадраты вручную при увеличении, используемом в узле сбора квадратов. Найдите квадраты, в которых фольга не повреждена, не выглядит обезвоженной и имеет идеальную толщину льда, и переместите стадию образца в интересующий квадрат.
Определите эуцентрическую высоту для положения столика с помощью альфа-воблера при наклоне столика около 15 градусов и отрегулируйте высоту Z, чтобы довести предметный столик до эуцентрической высоты, используя панель клавиатуры микроскопа. Убедитесь, что сдвиг изображения минимален во время процедуры альфа-колебания. Чтобы найти более точную высоту Z, оцените ее в узле фокусера по увеличению, используемому в квадратном узле захвата.
Отрегулируйте настройки узла фокусера и включите или отключите параметр точной фокусировки Z во время первоначальной очереди квадратов. Затем нажмите «Имитировать». Наклоните столик образца на желаемый угол наклона для сбора данных на истинной эуцентрической высоте и при необходимости отцентрируйте столик.
Нажмите кнопку Имитировать в квадратном узле сбора данных, чтобы начать постановку в очередь целевых объектов для экспозиции всего узла сбора данных. Затем выберите Z-фокусную цель и области с отверстиями, подходящими для экспозиции с большим увеличением, и отправьте цели в очередь на съемку. Верните стадию образца в ненаклоненное состояние, а затем перейдите к следующему квадрату.
Повторяйте эти шаги до тех пор, пока не будет поставлено в очередь достаточное количество целых экспозиций. После того, как все квадраты поставлены в очередь, перейдите ко всему узлу таргетинга и нажмите «Отправить цели в очереди». Выберите «Разрешить» для проверки пользователем выбранных целей в настройках узла и вручную осмотрите цели, выбранные узлом сбора экспозиции с большим увеличением, чтобы проверить, может ли автоматический искатель электромагнитных отверстий точно определить подходящие области для получения изображения при наклоне столика образца.
Убедившись в точности таргетинга, снимите флажок Разрешить пользователю проверку выбранных целей для автоматического сбора данных. Здесь показаны репрезентативные изображения сетки при квадратном увеличении с различными углами наклона, собранные вблизи и вдали от эуцентрической высоты Z. Центр луча обозначен центром красных концентрических колец, а зеленая стрелка указывает на интересующий квадрат.
Для справки к интересующему квадрату примыкает сломанная сетка. Здесь показаны репрезентативные экспозиции отверстий и средние значения 2D-класса, собранные при углах наклона 0 градусов, 30 градусов и 60 градусов. Хотя концентрация белка остается неизменной при различных углах наклона, более высокий угол наклона делает изображенную область более переполненной с точки зрения концентрации частиц.
Средние значения 2D-классов, затронутые переполненностью, показаны в этом красном поле. Простота протокола позволяет любому стандартному пользователю микроскопа легко адаптировать наклонную стратегию сбора данных.
