Стволовые клетки глиомы представляют собой субпопудрения клеток в глиоме, которые обычно устойчивы к химио- и лучевой терапии. Здесь мы описали метод быстрой идентификации комбинированной терапии, нацеленной на стволовые клетки глиомы, вместо дифференцированных клеток глиомы. По сравнению с другими методами, которые могут быть трудоемкими и сложными.
Этот протокол является относительно простым и быстрым, чтобы выявить потенциальные полезные комбинации лекарств. Начните с сбора стволовых клеток глиомы или ГСК из питательной среды и центрифугирования их в 70 раз G в течение трех минут при комнатной температуре. После удаления супернатанта переварите клетки с аккутазой в течение четырех минут при 37 градусах Цельсия.
Используя наконечник на 200 микролитров, несколько раз пипетка клеток диссоциирует и повторно суспендирует гранулу клетки. Добавьте ГСК плотностью 200 000 клеток в одном миллилитрах питательной среды в каждую лунку 12-луночной культурной пластины и инкубируют их в течение ночи. На следующий день добавьте 30 микролитров супернатанта вируса люциферазы-eGFP в каждую лунку пластины.
Центрифугируют клетки в 1000 раз G в течение двух часов, при 25 градусах Цельсия и инкубируют их в течение ночи. На следующий день замените среду в скважинах, собрав ГСК, центрифугируя их, удаляя супернатант, повторно испаскивая их в свежей среде и повторно покрывая их. Культивьять клетки еще 48 часов.
Понаблюдайте за пластинкой под флуоресцентным микроскопом и подтвердите появление GFP-положительных клеток. Сортируйте и собирайте ГСК с высокой флуоресценцией с помощью сортировщика проточных клеток и культивируйте их дальше. Обложите 96 хорошо оптическими нижними пластинами с внеклеточной матричной смесью, такой как матригель, и инкубируют их в течение одного часа при 37 градусах Цельсия.
Удалите излишки смеси и аккуратно промойте пластины один раз PBS, затем засейте клетки XG387-Luc плотностью 1000 клеток в 100 микролитрах питательной среды, а в каждую лунку покрытые пластины и культивируйте их на ночь. На следующий день понаблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы подтвердить их прикрепление к пластине. Далее готовят 200 микромолярный раствор темозоломида и два микромолярных раствора целевых агентов, в культуральная среда.
Для скрининга комбинированных лекарственных средств удалите пустую среду и добавьте среду, содержащую либо 200 микромолярный темозоломид, либо два микромолярных целевых агента, либо комбинацию обоих, в каждую скважину для трех технических реплик на лечение. Инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех дней. Сделайте снимки клеточной биолюминесценции в пластине с помощью системы визуализации спектра IVIS.
Используя встроенное программное обеспечение, создайте несколько круговых областей интересуемой области и количественно оцените клеточную биолюминесценцию. Чтобы определить потенциальных кандидатов, которые могли бы усилить антиглиобластомный эффект темозоломида, 20 целевых селективных ингибиторов малых молекул были проанализированы с помощью скрининга комбинации препаратов. Чувствительные значения индекса 13 целевых агентов были выше нуля, а пять из них были выше 0,1.
Чувствительный индекс двух лучших препаратов-кандидатов UMI-77 и A 83-01 был выше 0,25, что свидетельствует об их потенциале синергизма с темозоломидом. Комбинированное лечение темозоломидом и UMI-77 оценивали с использованием антипролиферативного анализа в матрице титрования шести на шесть доз. Значения комбинированного индекса были меньше одного.
А высокие значения одного агента были больше нуля для большинства комбинаций темозоломида и UMI-77 в разных концентрациях. Предположение об общем синергетическом взаимодействии темозоломида и UMI-77 в ГСК XG387 и XG328. Этот протокол также может быть применен при поиске комбинации лекарств с использованием адгезивных раковых клеток путем простого удаления пластинчатого покрытия.
