Дозированные он используется для выполнения эффективного секвенирования ChIP как эстер, так и не-эстер белков в коричневой липидной ткани изолированы от мыши. Основным преимуществом методики является то, что протокол был оптимизирован для эффективного иммунопреципиентации хроматин-ассоциированного комплекса из липидной ткани. Перед разрезом распылите усыпанную мышь 70%этанолом.
Поместите мышь с его спиной вверх, а затем сделать разрез вдоль шеи. Далее, расположенный BAT непосредственно под кожей между плечами и тщательно удалить тонкий слой белого жира. Перекрестная связь каждой площадки BAT в 10 миллилитров PBS, содержащих 1%формальдегид в течение 15 минут при 150 об/мин при комнатной температуре.
Через 15 минут, утолить перекрестное связывание, добавив 2,5 молярного глицина в BAT, в результате чего окончательная концентрация 125 миллимоляров. Поместите его на шейкер в течение пяти минут, вращаясь при температуре 150 об/мин при комнатной температуре. Впоследствии перенесите площадку BAT на 500 микролитров гипотонического буфера лиза и добавьте два бусинки из нержавеющей стали для каждой площадки BAT.
Затем используйте гомогенизатор ткани на основе бисера, чтобы измельчить ткань. Начните с пяти минут при максимальной мощности. При необходимости продлите время до однородной ткани и отделив отдельные клетки.
Перенесите образец в новую трубку и центрифугу при четырех градусах Цельсия при 16 000 Г в течение 10 минут. Через 10 минут перенесите супернатант в новую трубку и держите гранулы клетки на льду. Центрифуга супернатанта при четырех градусах Цельсия при 16 000 Г в течение 10 минут, чтобы предотвратить потерю плавающих клеток.
Затем отбросьте окончательный супернатант и повторно приостановьте обе клеточные гранулы вместе в 300 микролитров буфера лиза SDS с одним ингибитором протеазы. Инкубировать на льду в течение 10 минут. Далее, sonicate лисаты для генерации фрагментов ДНК от 200 до 500 пар основания в длину.
После sonication, удалить мусор центрифугации в течение 10 минут при 16000 Г при четырех градусах по Цельсию. Для выполнения иммунопреципиентации держите 1% раствора хроматина в стороне в качестве ввода ChIP и сохраняя входные данные на ночь при четырех градусах Цельсия. Далее добавьте антитела ChIP к одному миллилитру раствора хроматина и выполните параллельную иммунопреципитацию с соответствующей предиммунерной IgG или нормальной IgG одного и того же вида.
Кроме того, сохранить один миллилитр хроматина раствор для контроля антител. Инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию с вращением. Чтобы собрать иммунные комплексы, добавьте 50 микролитров белка A agarose 50%slurry в иммунные комплексы и инкубировать в течение одного часа при четырех градусах Цельсия с вращением при 150 об/мин.
Через час гранулы бисера центрифугации в течение одной минуты при 1000 раз G при четырех градусах по Цельсию. Выполните последовательные мойки бисера на 0,45 микрометра PVDF центробежных столбцов фильтра с буферами увеличения строгости путем первой передачи бисера в столбцах с 500 микролитров низкой соли мыть буфера. Затем, гранулы шарики в колонках в течение трех минут на 2500 G.Discard поток через.
Повторите мыть с высоким буфером мытья соли в соответствии с низким содержанием соли мыть процедур. Затем повторите процедуры с хлоридом лития и, наконец, с одним разом TE. После завершения промывки, elute иммунных комплексов, добавив 300 микролитров элюционного буфера для гранулированного бисера в колоннах. Инкубировать их при комнатной температуре в течение 30 минут на шейкере при 400 об/мин.
Впоследствии, собирать elute, вращая вниз колонны в течение трех минут при 2500 G в свежей трубке. Обратный перекрестных связей путем инкубации elute и входов, собранных при 65 градусов по Цельсию в одночасье. Чтобы восстановить ДНК, добавьте 300 микролитров фенола хлороформа IAA в элют и входы в соотношении один к одному и вихрь в течение 10 секунд.
Затем, спина вниз на 21000 G при четырех градусах по Цельсию в течение 20 минут. Держите гранулы и отбросить супернатант. Вымойте гранулы одним миллилитром холодного 70%этанола.
Затем вращайся вниз при 21 000 Г при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и высушите гранулы. Повторно приостанавливайте гранулы в 70 микролитров воды без ДНК для дальнейших процедур.
Вот пример ChIP и PCR с использованием BAT изолированы от дикого типа или GPS2-A нокаут мышей. Поскольку было установлено, что GPS2 необходим для выражения ядерных закодированных митохондриальных генов в разных клеточных линиях, набор GPS2 был протестирован на двух специфических ядерных закодированных митохондриальных генах. NDUFV1 и TOMM20 в BAT от мышей в качестве примеров ткани высоко обогащены в митохондриях.
GPS2 промоутер занятости был сравнен в GPS2-A нокаут мышей и диких товарищей типа письма. Ожидаемое снижение наблюдалось в GPS2 связывания на селективных генов цели в BAT от GPS2-A нокаут мышей. Используя описанный здесь протокол, повышенная привязка РНК-полимеразы 2 и репрессивный знак гистона, H3K9ME3, был записан в BAT от gps2-A нокаут мышей по сравнению с дикими товарищами буквы типа.
Эти результаты подтверждают набор GPS2 на отдельных ядерных закодированных митохондриальных генов и показывают, что GPS2 необходим для предотвращения накопления H3K9ME3 и, таким образом, требуется для срыва полюса два транскрипционной активности на целевых промоутеров. Протокол, описанный здесь, даже если специально оптимизирован для коричневой жировой ткани, представляет собой ценный инструмент для выполнения ChIP из других мурин и человеческих тканей. Не забывайте, что работа с фенохлороформом может быть чрезвычайно опасной.
Поэтому крайне важно всегда работать под капотом при использовании этого реагента.
