Этот протокол демонстрирует стандартные измерения, отражающие приспособленность, у комаров aedes aegypti, эти параметры приспособленности были выбраны, потому что они отражают репродуктивный успех, просты в измерении и часто упоминаются в литературе. Для начала поместите яичные листы в стерильную воду на ночь в инсектор для вылупления комаров трансгенного и дикого типа. Позвольте личинкам питаться в неограниченном количестве, давая несколько капель навозной жижи из корма для измельченной рыбы.
Чтобы убедиться в том, что взрослые особи являются девственницами, разделите куколок по половому признаку, переместите куколку на предметное стекло микроскопа и удалите лишнюю воду с помощью салфетки, чтобы обездвижить куколку. Под стереоскопом при двукратном и четырехкратном увеличении, используя кисть с тонким наконечником, расположите куколку лицевой стороной вверх. Затем визуально проанализируйте хвост на предмет различий в форме мочки гениталий.
Поместите куколок мужского и женского пола в отдельные чашки для воды в надлежащих условиях. Чтобы скрестить дикого типа или трансгенный генный драйв одного или двух самцов по массе с девственными самками дикого типа, добавьте обезболенных комаров в соотношении пять самцов на одну самку в картонные коробки от комаров, содержащие примерно 150 комаров. Через два-три дня обеспечьте источник крови в клетке, чтобы кормить самок в соответствии со стандартными методами выращивания.
Отсортируйте самок, которых кормили кровью, от некормленных самок, визуально проверяя их брюшную полость на предмет набухания и отбрасывая частично некормленных, откормленных и самцов. Поместите набухших самок обратно в соответствующие клетки. Через два-три дня поместите отдельных самок в 50 миллилитровые конические трубки, выстланные фильтровальной бумагой, предварительно помеченной карандашом.
Наполните все трубки пятью миллилитрами водопроводной воды. Положите небольшой кусочек ватного шарика, пропитанного изюмом или сахаром, на каждую коническую трубочку. Оставьте самок в инсекторе на один-два дня и дайте им отойти яйцами.
Затем подсчитайте количество яиц на каждой бумаге и рассчитайте среднюю плодовитость, как количество яиц, подсчитанных на каждой бумаге, делится на количество проверенных самок. Чтобы высушить бумаги для яиц, слейте воду из трубочек и поместите их обратно в инсекторы. Чтобы заморозить вскормленных кровью самок из завершенного исследования плодовитости, поместите клетки с комарами при температуре минус 20 градусов Цельсия примерно на 15 минут.
Рассеките левое крыло каждого комара, иссекая сустав крыла и грудную клетку и удаляя все крыло. С помощью щипцов поместите крыло на предметное стекло, затем добавьте одну каплю 15-миллилитрового исходного раствора, состоящего из 70% этанола и одной капли средства для мытья посуды, на крыло на предметном стекле с помощью переводной пипетки. Далее добавьте одну каплю 80% глицерина в защитный лист и поместите его на верхнюю часть крыла в растворе этилового мыла.
Сфотографируйте крылья, установленные на слайдах, с помощью камеры с 65-миллиметровым объективом. Используйте программное обеспечение TpsDig для определения двумерных декартовых координат ориентиров. Рассчитайте длину и площадь крыла, используя букву R, представленную в рукописи.
Вычислите размер центроида крыла, который является мерой размера, статистически независимой от формы, определяемой как квадратный корень из суммы квадратных расстояний каждого ориентира от центральной точки крыла Вылупите отдельные яйца F1 из бумаги, собранной у одиночных самок, в полипропиленовые прозрачные контейнеры для деликатесов, содержащие 100 миллилитров свежестерилизованной деионизированной воды. Через два-три дня после вылупления выньте листы из воды и дайте им высохнуть в течение ночи. Повторно вылупите яйцеклетки в тех же контейнерах, в которых они были первоначально вылуплены.
Через три-пять дней после первоначального вылупления визуально осмотрите личинки на наличие трансгенного маркера. Запишите количество положительных или отрицательных трансгенных личинок. Отбраковывайте отрицательные личинки.
Рассчитывайте фертильность как количество трансгенных или контрольных личинок, деленное на общее количество яиц. Чтобы определить соотношение полов, сложите количество самок или количество самцов, собранных на временной шкале исследования на одну взрослую самку комара. Разделите это число на количество куколок, собранных для одной и той же линии от комаров, созданной одной самкой.
Чтобы определить жизнеспособность личинок, сложите общее количество куколок, собранных за всю временную шкалу исследования на одну взрослую самку комара. Разделите это число на количество личинок, подсчитанных на одну отдельную взрослую самку комара для той же линии, подсчитанной ранее. Рассчитайте количество личинок до развития куколок как среднее время развития куколки после вылупления.
Чтобы определить мужской вклад, скрестите 50 трансгенных или контрольных самцов со 100 контрольными самками в картонные коробки по 64 унции, чтобы получилось 50 самцов со 100 самками. После спаривания предложите комарам кровавую пищу, следуя стандартным методам выращивания. Затем разделите отдельных полностью набухших самок в конические пробирки объемом 50 миллилитров, выстланные предварительно маркированной белой фильтровальной бумагой.
Оставьте самок на один-два дня в секторе и дайте им отяйцеваться. Дайте бумагам высохнуть в тубах в секторе не менее пяти дней. С помощью щипцов удалите бумаги и поместите их для штриховки.
Через два-три дня после вылупления выньте листы из воды и дайте им высохнуть. Повторно вылупите яйцеклетки в тех же контейнерах. Через три-пять дней после первоначального вылупления визуально осмотрите личинки на наличие трансгенного маркера.
Рассчитайте вклад самцов как количество трансгенных личинок F2, деленное на общее количество личинок на линию комаров. Пересадите 50 самцов и 50 самок комаров дикого типа или трансгенного возраста, которых не кормили кровью, в подходящий вольер. Отслеживайте количество погибших самцов и самок комаров каждый день.
Рассчитайте продолжительность жизни как среднее количество дней, прошедших до того, как комары погибнут в клетках, исключая комаров, которые умирают по неинформативным причинам. Время развития личинок до взрослых куколок и от куколок до взрослых особей оценивали с помощью ANOVA Краскала-Уоллиса и апостериорных сравнений Данна. Самцы комаров дикого типа имели более короткое время до окукливания, чем самки дикого типа, в то время как самцы D7L1 существенно не отличались по времени окукливания по сравнению с самками D7L1.
Самкам D7L1 потребовалось больше времени, чтобы достичь окукливания, чем самкам дикого типа, как и самцам D7L1, по сравнению с самцами дикого типа. Что касается времени развития куколок и взрослой особи, то дикий тип и самки D7L1 существенно не отличались, самцы дикого типа окукливаются быстрее, чем самки дикого типа и самцы D7L1. Самки комаров дикого типа так и не достигли своего среднего времени выживания во время исследования.
Все остальные группы достигли своей медианы выживаемости до 40 дней, с отчетливым временным разделением медианного времени выживания. Нокаутные комары D7L1 имели значительно меньшую площадь крыла, чем их собратья дикого типа, но различий в размере крыла или центроида не было. Комары, несущие одну копию кассеты генного драйва при экспрессии нано- или ZPG-промоторов, не имели существенной разницы в приспособленности по сравнению с широкой линией глаз Хиггса, за заметным исключением жизнеспособности личинок.
Собранные здесь данные о физической пригодности могут быть использованы в последующих приложениях, таких как математическое моделирование. Для исследований, оценивающих новые стратегии генетического контроля, необходимы исследования более крупных клеток в полуполевых условиях после небольших исследований приспособленности навыков, описанных здесь. Исследования физической формы в лаборатории помогают выявить непреднамеренные эффекты нокаутов или нокаутов генов.
Вырубка белка в слюне может вызвать стресс в процессе развития, в то время как генный драйв у первого и второго комаров показал более низкие показатели выживаемости личинок. Измерение приспособленности генного драйва сильно повлияло на его стойкость при моделировании популяций после математического моделирования.
