Этот протокол определяет четыре ключевые области, которые помогут улучшить методологию и обеспечить надежную трансплантацию легких. Во-первых, это воспроизводимая техника манжеты. Во-вторых, это точная и воспроизводимая идентификация четвертого межреберья, тщательное закрытие раны, а затем как восстановить и получить образцы для анализа.
Эти методы помогают разработать надежный метод трансплантации легких для работы над молекулярными механизмами и разработки терапевтических вмешательств. Начните с настройки хирургического устройства, включив оборудование для мониторинга частоты сердечных сокращений / насыщения кислородом и прогрев доски до 42 градусов по Цельсию. Кроме того, включите аппарат вентиляции и анестезии, чтобы предварительно разогреть испаритель изофлурана.
Наполните анестезиологический шприц 10 миллилитрами жидкого изофлурана и установите шприц на аппарат вентиляции легких и анестезии. Затем включите хирургический микроскоп с высотой и фокусом, отрегулированными в соответствии с предпочтениями, и запустите электрокоагулянт. Точно так же подготовьте и разложите хирургические инструменты.
Определите правильный размер ангиокатетера, который будет использоваться для изготовления манжет, исходя из массы тела крысы, обратившись к первой таблице. После подготовки манжет для легочной артерии, бронха и легочной вены поместите ангиокатетер соответствующего размера на стерильную поверхность под хирургическим микроскопом. Затем используйте хирургическое лезвие реберной спинки No 11, чтобы разрезать ангиокатетер под углом 90 градусов, чтобы сформировать корпус манжеты длиной два миллиметра с шириной и высотой в один миллиметр в верхней части корпуса манжеты.
После подготовки обертывания к операции сделайте ножницами разрез средней линии кожи на средней линии шеи длиной три-четыре сантиметра и тщательно рассеките подкожные ткани и мышцы с помощью щипцов. Для эндотрахеальной интубации наденьте шелковый шов 4-0 вокруг трахеи. Затем вставьте ангиокатетер 16 калибра в трахею и плотно завяжите шов вокруг трахеи двойным узлом, а затем одним узлом, чтобы удерживать ангиокатетер на месте.
Подключите ангиокатетер к аппарату искусственной вентиляции легких для поддержания хирургической плоскости анестезии у крысы с 1-2% изофлурана. Используйте ножницы для выполнения лапаро-стернотомии, как комбинированный срединный и поперечный разрез. Затем введите 1000 единиц гепарина на килограмм инсулиновым шприцем через нижнюю полую вену или IVC и подождите 10 минут для системного кровообращения.
Пока легкие вентиляционно, разрежьте правую и левую ушные раковины микрорассекающими пружинными ножницами, а затем введите ангиокатетер 18 калибра через легочную артерию, чтобы гравитационно промыть легкие 20 миллилитрами консервирующего раствора в шприце, подвешенном на 28 сантиметрах воды, соединенном с трубкой и ангиокатетером. Отсоедините аппарат искусственной вентиляции легких от эндотрахеальной трубки, чтобы подключить его к пятимиллилитровому шприцу, наполненному соответствующим объемом воздуха в зависимости от массы тела. После одного часа теплой ишемии иссеките блокаду сердца и легких с помощью микрорассекающих пружинных ножниц и щипцов и поместите на стерильную марлю, смоченную ледяным PBS, на стерильную чашку Петри на льду.
Аккуратно обрежьте прикорневую область левого легкого пружинными ножницами Vannas-Tubingen и обработайте левую легочную вену, легочную артерию и бронх. Используйте противомоскитный гемостат, чтобы захватить язычок манжеты. Затем возьмите дистальный конец легочной вены, легочной артерии или бронха через соответствующий корпус манжеты и выверните лишнюю ткань вокруг манжеты, прежде чем закрепить 8-0 нейлоновый шов.
После этого используйте пружинные ножницы Vannas-Tubingen, чтобы обрезать лишнюю ткань и манжету вокруг корпуса манжеты. Чтобы подготовить крысу-реципиента, проведите линию на груди крысы от надгрудинной выемки до мечевидного отростка. В середине этой линии проведите линию вдоль левой стороны грудной клетки, которая измеряет половину измерения от надгрудинной выемки до мечевидного отростка.
Используя оптоволоконный кабель, подключенный к светодиодной лампе из набора для эндотрахеальной интубации, визуализируйте и интубируйте реципиента с помощью ангиокатетера 16 калибра. После того, как легкие будут вытащены, поместите стерильную марлю вокруг левого легкого, удерживая ее бульдожьим зажимом Диффенбаха, и наложите зажим Ясаргила на прикорневую область левого легкого как можно ближе. Когда крыса будет подготовлена, приступайте к анастомозу легочной вены, наложив нейлоновый шов 7-0 на легочную вену реципиента.
Разрезайте легочную вену реципиента с помощью пружинных ножниц Vannas-Tubingen, поперечно разрезав верхнюю и нижнюю сегментарные вены как можно дистальнее, и промойте кровь 0,2 миллилитра одной международной единицы на миллилитр гепаринизированного физиологического раствора с помощью инсулинового шприца. Поместите донорское легкое, обернутое ледяной, влажной, стерильной марлей, в грудную полость и вставьте легочную вену донора с манжетой в легочную вену реципиента, прежде чем закрепить анастомоз с помощью предварительно установленного нейлонового шва 7-0. При анастомозе бронхов или бронхов наложите нейлоновый шов 7-0 на бронх реципиента, прежде чем разрезать бронх реципиента, поперечно разрезая верхнюю и нижнюю сегментарные дыхательные пути как можно дистальнее.
После введения донорского бронха в манжету в бронх реципиента закрепите анастомоз предварительно позиционированным нейлоновым швом 7-0. Далее выполняют анастомоз легочной артерии, как описано ранее. Чтобы обеспечить репродуктивную терапию и вентиляцию трансплантированного донорского легкого, снимите зажим Ясаргила на головоломке, а затем закройте торакотомический разрез нейлоновым швом 6-0.
Соберите жидкость BAL из нативных или пересаженных легких по желанию. Соотношение влажного и сухого веса долей было рассчитано для измерения отека легких. Трансплантированная доля показала значительное увеличение соотношения влажного и сухого веса по сравнению с родной долей донора или реципиента, что указывает на отсутствие отека легких.
По нашему мнению, два важнейших шага этой процедуры заключаются в том, чтобы, во-первых, точно использовать анатомические ориентиры для идентификации четвертого межреберья, а во-вторых, выбрать и соответствующим образом использовать манжеты, чтобы иметь воспроизводимую технику манжеты. Модель трансплантации легких крысы, которая является одновременно воспроизводимой и последовательной, является основой для молекулярных исследований ишемии, репрофузии и трансплантации в целом.
