Este protocolo identifica quatro áreas-chave para ajudar a melhorar a metodologia e ter transplante pulmonar confiável. A primeira é uma técnica de cuffing reprodutível. A segunda é identificar com precisão e reprodutibilidade o quarto espaço intercostal, um fechamento completo da ferida e, em seguida, como recuperar e obter amostras para análise.
Essas técnicas ajudam a desenvolver um método confiável de transplante pulmonar para trabalhar mecanismos moleculares e desenvolver intervenções terapêuticas. Comece com a configuração do dispositivo cirúrgico ligando o equipamento de monitoramento de frequência cardíaca/saturação de oxigênio e aquecendo a placa a 42 graus Celsius. Além disso, ligue a máquina de ventilação e anestesia para pré-aquecer o evaporador de isoflurano.
Encha uma seringa de anestesia com 10 mililitros de isoflurano líquido e monte a seringa no aparelho de ventilação e anestesia. Em seguida, ligue o microscópio cirúrgico com a altura e o foco ajustados às preferências e inicie o eletrocautério. Da mesma forma, prepare e disponha as ferramentas cirúrgicas.
Determinar o tamanho correto do calibre do cateter angio a ser usado para fazer os manguitos com base no peso corporal do rato, consultando a tabela um. Após o preparo dos manguitos para a artéria pulmonar, brônquio e veia pulmonar, coloque o cateter angio do tamanho apropriado em uma superfície estéril sob o microscópio cirúrgico. Em seguida, use uma lâmina cirúrgica número 11 para cortar o cateter angio em um ângulo de 90 graus para formar um corpo de manguito de dois milímetros de comprimento com um milímetro de largura e altura na parte superior do corpo do manguito.
Depois de preparar o envoltório para a cirurgia, faça uma incisão de pele mediana de três a quatro centímetros de comprimento, no meio do pescoço, com a tesoura, e disseque cuidadosamente os tecidos e músculos subcutâneos usando pinças. Para a intubação endotraqueal, fio uma sutura de seda 4-0 ao redor da traqueia. Em seguida, insira um cateter angiocateter de calibre 16 na traqueia e amarre a sutura ao redor da traqueia firmemente com um nó duplo, seguido de um nó único para manter o cateter angio no lugar.
Conectar o cateter angio ao ventilador para manter um plano cirúrgico de anestesia no rato com isoflurano a 1 a 2%. Use a tesoura para realizar uma laparoesternotomia, como uma incisão combinada na linha média e transversal. Em seguida, injetar 1.000 unidades por quilograma de heparina com uma seringa de insulina através da veia cava inferior, ou VCI, e aguarde 10 minutos para circulação sistêmica.
Enquanto os pulmões estão ventilando, corte as aurículas direita e esquerda com uma tesoura de mola microdissecante e, em seguida, introduza um cateter angiocateter de calibre 18 através da artéria pulmonar para lavar os pulmões por gravidade com 20 mililitros de solução de preservação em uma seringa pendurada a 28 centímetros de água, conectada à tubulação e ao cateter angio. Desconecte o ventilador do tubo endotraqueal para conectar a uma seringa de cinco mililitros preenchida com um volume adequado de ar com base no peso corporal. Após uma hora da isquemia quente, excisão do bloco coração-pulmão com a tesoura e pinça de mola microdissecante e colocar em uma gaze estéril umedecida com PBS gelado em uma placa de Petri estéril sobre gelo.
Corte cuidadosamente a área hilar do pulmão esquerdo com tesoura de mola de Vannas-Tubingen e obtenha a veia pulmonar esquerda, a artéria pulmonar e o brônquio. Use um hemostático de mosquito para pegar a guia do manguito. Em seguida, pegue a extremidade distal da veia pulmonar, artéria pulmonar ou brônquio através do corpo apropriado do manguito e everte o tecido extra ao redor do manguito antes de fixar com 8-0 sutura em náilon.
Uma vez feito, use a tesoura de mola Vannas-Tubingen para aparar o tecido extra e o manguito ao redor do corpo do manguito. Para preparar o rato receptor, desenhe uma linha no peito do rato desde a incisura supraesternal até o processo xifoide. No meio dessa linha, desenhe uma linha ao longo do lado esquerdo do tórax que mede metade da medida desde a incisura supraesternal até o processo xifoide.
Usando o cabo de fibra óptica conectado a uma luz LED do kit de intubação endotraqueal, visualize e intube o receptor com um cateter angiocateter de calibre 16. Uma vez que os pulmões são retirados, coloque uma gaze estéril ao redor do pulmão esquerdo enquanto o segura com pinça de buldogue Dieffenbach e aplique uma pinça de Yasargil na área hilar do pulmão esquerdo o mais proximalmente possível. Quando o rato estiver preparado, proceda à anastomose da veia pulmonar colocando sutura de náilon 7-0 ao redor da veia pulmonar do receptor.
Incisar a veia pulmonar do receptor usando a tesoura de mola de Vannas-Tubingen, cortando transversalmente as veias segmentares superior e inferior o mais distalmente possível, e lave o sangue com 0,2 mililitros de uma unidade internacional por mililitro de solução salina heparinizada usando uma seringa de insulina. Coloque o pulmão do doador envolvido com uma gaze gelada, úmida e estéril na cavidade torácica e insira a veia pulmonar com balonete do doador na veia pulmonar do receptor antes de garantir a anastomose com a sutura de náilon 7-0 pré-posicionada. Para a anastomose brônquica ou brônquia, colocar uma sutura de náilon 7-0 ao redor do brônquio do receptor antes de incisar o brônquio do receptor, cortando transversalmente as vias aéreas segmentares superior e inferior o mais distalmente possível.
Após a inserção do brônquio braçado do doador no brônquio do receptor, fixar a anastomose com fio de náilon 7-0 pré-posicionado. Em seguida, realizar a anastomose da artéria pulmonar conforme descrito anteriormente. Para permitir a reprofusão e ventilação do pulmão doador transplantado, retirar a pinça de Yasargil no hilo, seguida do fechamento da incisão da toracotomia com fio de náilon 6-0.
Coletar o líquido de LBA dos pulmões nativos ou transplantados conforme desejado. A relação entre o peso úmido e seco dos lobos foi calculada para medir o edema pulmonar. O lobo transplantado apresentou aumento significativo na relação peso úmido/seco em relação ao lobo nativo do doador ou receptor, indicando ausência de edema pulmonar.
Em nossa opinião, as duas etapas críticas deste procedimento são: uma, usar com precisão os pontos anatômicos para identificar o quarto espaço intercostal e, em seguida, dois, selecionar e usar adequadamente os manguitos para ter uma técnica de cuffing reprodutível. Um modelo de transplante pulmonar de ratos reprodutível e consistente é uma base para investigações moleculares sobre isquemia, reprofusão e transplante em geral.
