Экспериментальные модели донорства органов, как правило, имитируют изолированные ситуации повреждения тканей, связанные с процессом смерти и/или событиями, связанными с сохранением и имплантацией органа. Эти модели очень полезны при разработке методов лечения, направленных на увеличение числа доноров и, следовательно, уменьшение весового списка потенциальных реципиентов. Соответственно, стало важным разработать различные модели, например, вызывающие смерть мозга и смерть в кровообращении.
Так как эти события связаны с различными вредоносными процессами, которые нарушают функциональность донорских органов и тканей. Анестезия и предоперационная подготовка. Поместите крысу в закрытую камеру с 5%-ным изофлураном на одну-четыре минуты.
Убедитесь в правильности анестезии, проверив рефлекс защемления пальцев ног. При отсутствии рефлекторных реакций выполняют оротрахеальную интубацию, ангиокат 14 калибра с помощью детского ларингоскопа. С помощью предварительно отрегулированного аппарата искусственной вентиляции легких и дыхательного объема 10 миллилитров на килограмм, 90 циклов в минуту и PEEP 3,0 см H2O подключите трахеальный катетер к аппарату искусственной вентиляции легких и отрегулируйте концентрацию анестетика до 2%Удалите шерсть с интересующих областей, головы, шеи, груди и живота.
Затем с помощью марли промывают операционное поле и хвост животного спиртовым раствором Хлоргексидина диглюконата, 2%-ную процедуру дезинфекции повторяют трижды. Отрежьте кончик хвоста животного, положите большой и указательный пальцы на основание хвоста, а затем нажмите и сдвиньте их в сторону от основания. Возьмите образец периферической крови, 20 микролитров через хвост для общего количества лейкоцитов. Трахеостомия.
Выполняют продольное рассечение шейной трахеи, начиная от средней трети шеи до надгрудинной выемки. Примерно 1,5 сантиметра разреза. После разреза кожи и подкожной клетчатки рассекают шейные мышцы до обнажения трахеи.
Поместите шелковую лигатуру 2.0 под трахею. С помощью микроножниц трахеостомируют верхнюю треть трахеи, чтобы добиться равномерной вентиляции. Горизонтально разрежьте трахею между двумя хрящевыми кольцами, чтобы вместить диаметр металлической канюли, 3,5 сантиметра.
Вставьте вентиляционную трубку и зафиксируйте ее подготовленными лигатурами. Подсоедините вентиляционную трубку к системе вентиляции мелких животных. Проветривайте крысу с дыхательным объемом 10 миллилитров на килограмм, скоростью 70 циклов в минуту и PEEP 3 сантиметра H2O.
Катетеризация бедренной артерии и вены. Итак, обнажают бедренный треугольник через небольшой разрез, примерно 1,5 сантиметра в паховой области. Идентификация и изоляция бедренных сосудов.
Для этой процедуры используют стереомикроскоп 3,2-кратного увеличения. Поместите две шелковые лигатуры 4.0 под кровеносные сосуды, вену или артерию, одну дистально, а другую проксимально. Закройте самую дистальную лигатуру и поместите предварительно отрегулированный узел в проксимальную лигатуру и потяните.
Введите катетер через небольшой предварительно сформированный разрез в сосудах. Зафиксируйте канюлю, чтобы избежать вывиха. Подключите артериальный катетер к датчику давления и системе мониторинга жизненно важных показателей для записи MAP.
Датчик должен располагаться на уровне сердца животного. Подключите катетер для стрельбы из лука к датчику давления и системе мониторинга жизненно важных показателей для записи MAP. Датчик должен располагаться на уровне сердца животного.
Поместите шприцевой катетер 3 миллилитра в вену, стремясь к гидратации и обескровливанию, когда это необходимо. Индукция геморрагического шока. Через венозную ось и с помощью гепаринизированного шприца удаляйте небольшие объемы крови до тех пор, пока не будут достигнуты значения MAP примерно в 50 миллиметров ртутного столба.
Таким образом, устанавливается геморрагический шок. Обратите внимание, аликвоты крови необходимо сдавать с интервалом в 10 минут. Поддерживайте стабильное давление на уровне примерно 50 миллиметров ртутного столба в течение 360 минут.
Для этого удалите или добавьте аликвоты крови, если давление повышается или снижается соответственно. Поставьте рядом источник тепла, чтобы избежать переохлаждения. В конце протокола соберите легочную блокаду при общей емкости легких для сбора и либо мгновенно заморозьте в жидком азоте, либо поместите в фиксирующий раствор для дальнейших исследований.
Индукция циркуляторной смерти. Чтобы вызвать циркуляторную смерть, вводят 150 миллиграммов на килограмм тиопентала натрия через венозный катетер. Затем отключите систему вентиляции.
Обратите внимание на прогрессирующее снижение MAP. Животное должно оставаться в теплой ишемии при комнатной температуре в течение 180 минут. В конце протокола снова подключите легкие к аппарату искусственной вентиляции легких и соберите блокаду легких с общей емкостью легких для сбора.
И либо мгновенно замораживают в жидком азоте, либо помещают в фиксирующий раствор для дальнейших исследований. Индукция смерти мозга. Поместите крысу в положение лежа.
Снимите кожу с черепа с помощью хирургических ножниц. Пробурите скважину калибром 1 миллиметр, 2,8 миллиметра спереди, 10 миллиметров вентрально и 1,5 миллиметра латерально от сагиттального шва. Введите весь баллонный катетер в полость черепа и убедитесь, что баллон предварительно заполнен физиологическим раствором, 500 микролитров.
С помощью шприца быстро надуйте катетер. Подтвердите смерть мозга, наблюдая резкое повышение уровня MAP. Рефлекс Кушинга, отсутствие рефлексов, двусторонний мидриаз и апноэ.
После подтверждения прекратить анестезию и держать животное на искусственной вентиляции легких в течение 360 минут. Поставьте рядом источник тепла, чтобы избежать переохлаждения. В конце протокола соберите легочную блокаду при общей емкости легких для сбора. Результаты.
После катетерной инсуффляции в группе смерти головного мозга наблюдалось резкое повышение уровня артериального давления. Гипертонический пик является своеобразным событием, связанным с повышением внутричерепного давления, и может рассматриваться как первое свидетельство установления смерти мозга. Этот пик давления сопровождался быстрым снижением MAP.
Гипотензия сохранялась в течение примерно 50 минут, после чего уровни MAP возвращались к значениям, близким к исходным. В отличие от группы смерти мозга, снижение MAP в группе геморрагического шока связано с выводом аликвот крови в первые 10 минут эксперимента. Гиповолемический шок сохранялся в течение 360 минут.
Через шесть часов после начала геморрагического шока у животных наблюдалось повышенное сопротивление легочной ткани, за которым последовало снижение податливости дыхательной системы. Для оценки изменений отека легких исследовали соотношение влажной и сухой массы. В этом контексте смерть мозга показала больший отек по сравнению с группой геморрагического шока и смерти от кровообращения.
Наконец, группа геморрагического шока ассоциировалась с увеличением общего количества системных лейкоцитов по сравнению с исходными значениями, а также по отношению к группе смерти головного мозга. Это сопровождалось повышением уровня экспрессии IL1 Beta в группе смерти мозга и геморрагического шока, чем в группе циркуляторной смерти. Группа геморрагического шока также показала более высокие уровни TNF Alpha по сравнению с группой смерти мозга и группой циркуляторной смерти.
Модели доноров органов, описанные здесь, являются потенциальными инструментами в изучении изменений, связанных с различными методологиями забора трансплантатов, и могут обеспечить средства, с помощью которых можно получить полное понимание влияния качества этих органов на результаты после трансплантации. Учитывая воспроизводимость и достоверность представленных здесь методологий.
