Этот метод позволяет охарактеризовать, какие химиотерапевтические препараты гидролизуются SAMHD1 и может быть использован в качестве скринингового анализа для выявления низкомолекулярных ингибиторов этого фермента. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он прост, недорог и дает огромное количество информации о том, как различные малые молекулы взаимодействуют с этим ферментом. Демонстрацию процедуры будет демонстрировать Мириам, постдок из группы.
Для начала подготовьте полный реакционный буфер SAMHD1, добавив Tween-20 и TCEP к конечным концентрациям 0,005% и 0,3 миллимоляра соответственно. Приготовьте стоп-раствор ЭДТА, добавив ЭДТА до конечной концентрации 7,9 миллимоляра в полном реакционном буфере SAMHD1. Приготовьте малахитовый зеленый, или рабочий раствор МГ, смешав 10 частей маточного раствора МГ с 2,5 частями 7%-ного молибдата аммония и 0,2 частями 11%-ного твин-20.
С помощью многоканальной пипетки последовательно разбавляйте испытуемые соединения в соответствующем растворителе до концентрации, в 100 раз превышающей конечную конечную концентрацию, в прозрачной полипропиленовой пластине с круглым дном на 96 лунок. далее разбавляют эти соединения до 25-кратной конечной концентрации с помощью полного реакционного буфера SAMHD1 для поддержания конечной концентрации растворителя ниже 1%Перелейте пять микролитров разбавленного компонента в соответствующие лунки прозрачной 384-луночной плоскодонной пробирной планшета и повторите процедуру с контрольными образцами, содержащими только растворители. Для приготовления ферментной мастер-смеси разбавьте рекомбинантный человеческий белок SAMHD1 и рекомбинантную пирофосфатазу в полном реакционном буфере SAMHD1 до четырехкратной желаемой конечной концентрации.
Приготовьте активатор или субстрат dGTP, разбавив раствор в полном реакционном буфере SAMHD1 до достижения концентрации 50 микромоляров. В лунки, содержащие разбавления соединений и контроль только растворителей, дозируют пять микролитров мастер-смеси пирофосфатазы SAMHD1, а в лунки без контроля ферментов добавляют пять микролитров полного реакционного буфера SAMHD1. Затем дозируют 10 микролитров раствора dGDP во все лунки для запуска реакции и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре.
Чтобы остановить реакцию, добавьте 20 микролитров стоп-раствора ЭДТА. После добавления 10 микролитров рабочего раствора MG во все лунки перемешайте содержимое с помощью орбитального встряхивателя микролунок и центрифугируйте планшет при 1000 x g в течение одной минуты. Инкубируйте планшет в течение 20 минут при комнатной температуре и считывайте поглощение на длине волны 630 нанометров в планшетном считывателе с микролунками.
Вычислите среднеквадратическое отклонение положительных контрольных скважин, а затем вычислите среднее значение. Аналогично для скважин с отрицательным контролем рассчитайте стандартное отклонение, а затем вычислите среднее значение. Расчет Z-фактора является показателем качества пробы.
Нормализуйте каждое значение поглощения к средним значениям положительного и отрицательного контроля. Установка положительного элемента управления как 100%SAMHD1 активности, а отрицательного элемента управления как 0%SAMHD1 активности. График активности SAMHD1 зависит от концентрации соединения и соответствует четырехпараметрической кривой дозового отклика с переменным наклоном, позволяющей определить половину максимальной ингибирующей концентрации соединения.
Разбавьте нуклеотидные аналоговые запасы и полный реакционный буфер SAMHD1 до четырехкратной конечной концентрации и перелейте пять микролитров в соответствующие лунки 384-луночного планшета. Чтобы приготовить фермент SAMHD1 или мастер-смесь пирофосфатазы, разбавьте рекомбинантный человеческий белок SAMHD1 и пирофосфатазу Escherichia coli в полном реакционном буфере SAMHD1 до удвоенной конечной концентрации, превышающей желаемую конечную концентрацию. Готовят только раствор пирофосфатазы, разбавляя рекомбинантную пирофосфатазу Escherichia coli до удвоенной желаемой конечной концентрации в полном реакционном буфере SAMHD1.
Аналогичным образом приготовьте активаторы GTP и dGTP alpha S, разбавив сырье в полном реакционном буфере SAMHD1 до концентрации, в четыре раза превышающей конечную. Распределите пять микролитров активатора, GDP или dGTP alpha S, или полный реакционный буфер SAMHD1 в соответствующие лунки 384-луночного планшета, содержащего аналоги нуклеотидов. Начните реакцию, дозировав 10 микролитров мастер-смеси для пирофосфатазы SAMHD1, только пирофосфатазы или полного реакционного буфера SAMHD1 в соответствующие лунки и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
После остановки реакции с помощью стоп-раствора ЭДТА добавьте во все лунки 10 микролитров рабочего раствора МГ. После того, как содержимое будет перемешано, центрифугируйте планшет при 1000 x g в течение одной минуты и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем измерьте поглощение на длине волны 630 нанометров.
Рассчитайте средние значения поглощения пирофосфатазы только для реакционных ям, которые будут являться фоновым значением. Затем вычитают фоновое значение из соответствующих лунок в реакциях SAMHD1 или пирофосфатазы. Наконец, постройте график скорректированных значений поглощения для каждого аналога нуклеотида с буферными условиями GTP и dGTP alpha S.
В настоящем исследовании абсорбент увеличивался с увеличением концентрации фосфата натрия после инкубации с малахитовым зеленым реагентом и достигал насыщения при концентрации 0,25 миллимоляра. Линейный диапазон обнаружения фосфатов виден от 0,004 до 0,03 миллимоляра. Проиллюстрировано требование к компонентам анализа для достижения измеримой активности SAMHD1.
Ни SAMHD1, ни пирофосфатаза сами по себе не могут генерировать органический фосфат в присутствии dGTP. Однако при наличии всех компонентов анализа наблюдалось увеличение сигнала. Кривые дозового отклика, полученные для соединений-ингибиторов SAMHD1, показали, что увеличение концентрации эффективно ингибирует активность SAMHD1.
Гидроксимочевина не ингибирует активность SAMHD1 in vitro, на что указывала неизмененная активность SAMHD1 при увеличении дозы гидроксимочевины. Связывание dGTP с обоими аллостерическими сайтами активирует SAMHD1, обеспечивая последующий гидролиз этого нуклеотида, в то время как три других канонических dNTP сначала требуют активации GTP первого аллостерического сайта, прежде чем они смогут связать второй аллостерический сайт, а затем гидролизоваться в каталитическом центре. Для нуклеотидных аналогов клофарабинтрифосфат является аллостерическим активатором второго сайта и субстратом, так как активность наблюдается в присутствии ГТФ.
В то время как цитарабин трифосфат способен занимать только каталитический сайт, так как dGTP альфа S необходим для наблюдения за активностью. Активности с гемцитабина трифосфатом не наблюдалось. После идентификации малых молекул, ингибирующих SAMHD1 в этом анализе, с помощью физических подходов, таких как анализ теплового сдвига, можно использовать для исследования взаимодействия с мишенью.
Показанный здесь метод помог нам понять, какие из противораковых препаратов могут быть гидролизованы SAMHD1, и установить этот фермент в качестве потенциальной терапевтической мишени для преодоления лекарственной устойчивости.
