Этот протокол описывает анализ ангиогенеза прорастания in vitro, который повторяет многие особенности образования кровеносных сосудов и может быть использован для тестирования лекарств. Этот метод прост в реализации в лаборатории, надежен и масштабируем. Он имеет много общего с анализами с использованием эндотелиальных клеток и микросфер человека.
Эта модель надежно имитирует фенотип, демонстрирующий дефектный отбор клеток кончика эндотелия и ориентированную миграцию эндотелиальных клеток, что приводит к патологическому ангиогенезу. Работа может дать представление о механизмах, регулирующих прорастающий ангиогенез, ключевых генах и задействованных сигнальных путях, в частности, путем проведения генетического скрининга. Основной проблемой является поддержание качества или плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток мыши в культуре. Важна регулярная проверка стадий плюрипотентности и морфологии клеточных линий.
Также важно выполнить кариотипирование клеточных линий, поскольку они имеют тенденцию культивировать хромосомы. Начните с покрытия одной лунки из шести луночных клеточных культур 500 микролитрами 0,1%-ного раствора желатина и поместите ее в инкубатор углекислого газа на 30 минут. Затем вымойте пластины с желатиновым покрытием PBS и добавьте 500 микролитров свежеприготовленного CM плюс минус средний.
Чтобы получить чистую популяцию эмбриональных стволовых клеток мыши или мЭСК, трипсинизируйте планшет для клеточной культуры 10-кратным буфером TVP в течение 30 секунд при комнатной температуре. Затем ресуспендируют клетки в одном миллилитре среды для дифференцировки мезодермы, прежде чем перенести их в шестилуночную пластину, покрытую желатином, в течение 30 минут, чтобы позволить эмбриональным фибробластам мыши прикрепляться, в то время как мЭСК остаются в суспензии. Перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку перед подсчетом живых клеток с помощью гемоцитометра Neubauer в красителе Trypan blue.
Затем центрифугируйте клетки при 200 грамах в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в соответствующем объеме среды для дифференцировки мезодермы. Приготовьте четыре 94-миллиметровые посуды из полистирола с низкой насадкой, добавив на дно 15 миллилитров стерильной воды.
После переноса клеточной суспензии в стерильный пластиковый резервуар загрузите четыре позиции многоканальной пипетки с 22 микролитрами клеточной суспензии на канал. Поднимите и поместите перевернутую крышку 94-миллиметровой тарелки на чистую поверхность проточной камеры внутренней стороной вверх. Нанесите 40 капель клеточной суспензии на внутреннюю поверхность каждой крышки и осторожно переверните крышку, чтобы положить ее обратно на блюдо, чтобы капли были обращены к воде.
Инкубируйте посуду в углекислотном инкубаторе в течение четырех дней, считая это нулевым днем дифференциации. После четырех дней инкубации соберите свисающие капли в коническую трубку объемом 15 миллилитров с помощью пипетки P1000. Дайте ЭБ осадок в пробирке перед удалением надосадочной жидкости.
Ресуспендируют ЭБ в трех миллилитрах 2-кратной среды для сосудистой дифференцировки перед переносом и равномерным распределением суспензии ЭБ в 60-миллиметровой чашке, покрытой агаром. Инкубируйте посуду в инкубаторе с углекислым газом до девятого дня со средним обновлением каждые два дня. Приготовьте 35-миллиметровую культуральную чашку, добавив на ее дно один миллилитр проращивающей среды.
Чтобы вызвать гелеобразование, инкубируйте блюдо при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Соберите девятидневные ЭБ из одной чашки агара в коническую трубку объемом 15 миллилитров и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендировать ЭБ в двух миллилитрах среды для холодного проращивания для переноса в культуральную чашку, покрытую первым слоем среды для проращивания.
Распределите ЭБ по всей тарелке, убедившись, что они находятся на равном расстоянии друг от друга. Образование первого ростка должно быть очевидным после инкубации в течение примерно 24-48 часов. На 12-й день с помощью шпателя аккуратно перенесите коллагеновый гель, содержащий ЭБ, на предметное стекло.
Удалите лишнюю жидкость с помощью пипетки и обезвоживайте гель, положив поверх геля марлевый лист нейлонового льна и впитывающие фильтрующие карты. Приложите давление весом 250 грамм в течение двух минут. Затем снимите нейлоновую бумагу, чтобы слайды высохли на воздухе в течение 30 минут при комнатной температуре.
После высыхания зафиксируйте ЭБ раствором цинка на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день снимите фиксатор перед промыванием предметных стекол пять раз с помощью PBS. Проникните в ЭБ и ПБС, содержащие 0,1% Triton X-100.
Через 15 минут удалите раствор для пермеабилизации, чтобы пять раз промыть предметные стекла PBS в течение пяти минут. Инкубируйте ЭБ в блокирующем буфере в течение одного часа при комнатной температуре и промывайте PBS в течение пяти минут. Затем добавьте первичное антитело, разведенное в блокирующем буфере, и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение ночи.
Затем инкубируйте предметные стекла с вторичным антителом Goat Anti-Rat Alexa 555 в блокирующем буфере в течение двух часов при комнатной температуре. После инкубации промойте предметные стекла три раза PBS в течение пяти минут и один раз водой перед установкой их для микроскопии. Анализ 3D-прорастающего ангиогенеза проводился на трех БЭ с двумя препаратами, DC101 и DAPT.
Оба соединения постепенно блокировали ангиогенез в модели БЭ с увеличением концентраций. Различные концентрации лекарств в БЭ показали, что высокие дозы DC101 ингибируют количество и длину ростков сосуда. DAPT оказывал противоположные эффекты в дозе один микромоль на литр.
DAPT сильно увеличил количество клеток эндотелия на ростки сосуда, имеющие неправильный фенотип даже при низких дозах, по сравнению с DC101. Дефектное прорастание сосудов наблюдалось в наследственных геморрагических телеангиэктазиях БЭ из контрольных и гетерозиготных генотипов ACVRL1 ACVRL1 с многочисленными неправильными фенотипами, прорастающими под случайными углами относительно родительских сосудов. Смеси линии mESC дикого типа в соотношении один к одному с немеченой линией mESC дикого типа привели к равному вкладу в ведущие клетки эндотелия кончика.
Был проведен микроскопический анализ этого репрезентативного химерного БЭ для определения генотипического происхождения ведущих эндотелиальных кончиковых клеток. Для количественной оценки покрытия фрески клетками ростка сосуда БЭ фиксировали и окрашивали на маркеры эндотелиальных клеток, PECAM и маркер фресочных клеток, актин альфа-гладких мышц. Изображение с большим увеличением показало, что один отдельный росток сосуда был окружен клетками фрески.
Бинарную трансформацию проводили после разделения цветовых каналов, и количественно определяли соотношение PECAM-положительных сосудов, покрытых альфа-SMA-положительными клетками фрески. Генетический фон эмбриональной линии стволовых клеток также является ключевым фактором, который исследователи должны учитывать, поскольку некоторые линии прорастают лучше, чем другие. Этот метод может быть использован для проведения генетического скрининга с использованием подходов РНК-интерференции или банка эмбриональных стволовых клеток мыши, содержащих генные мутации.
