Этот протокол может быть использован для изучения различных движений насекомых, функций белков насекомых и взаимодействия между вирусом и насекомым-переносчиком in vivo. Этот метод эффективен и информативен. Структуры кишечника насекомых и вспомогательных клеток четко визуализируются при просмотре с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
Продемонстрирует процедуру Лу Чжан, доктор философии из нашей лаборатории. Для начала перенесите невирулентных насекомых из стеклянных стаканов на свежий южный рис с черными полосами карликового вируса, SRBSDV, зараженные растения риса, покрытые сеткой, защищающей от насекомых, в течение двухдневного периода доступа к заражению вирусом. Затем соберите насекомых в стеклянные стаканы, содержащие свежие проростки риса.
Через двое суток соберите насекомых из стеклянных стаканов с помощью ручного аспиратора для вскрытия и иссечения кишечника. Приготовьте 0,01 моляра PBS, 4% параформальдегида и 2% Triton X-100, как описано в текстовой рукописи. С помощью пипетки поместите 100 микролитров PBS на предметное стекло и поместите предметное стекло на предметное стекло и поместите предметное стекло на столик оптического микроскопа.
Используйте ручной аспиратор, чтобы собрать взрослых особей, инфицированных SRBSDV, из стеклянных стаканов и поместить их в 1,5-миллилитровую пробирку на льду, чтобы парализовать насекомых. Перенесите парализованного взрослого человека в 100 микролитров PBS на предметное стекло животом вверх. Используйте пинцет, чтобы зажать тело и удалить голову другим набором пинцета.
Одним набором пинцетов зажмите боковые стороны живота и зажмите яйцеклад или копулятивный орган хвоста другим набором, затем осторожно потяните межсегментарную мембрану одного брюшного сегмента, чтобы медленно обнажить кишку в брюшной полости. Продолжайте отрывать оболочку и постепенно вытаскивайте всю кишку из брюшной полости. Осторожно оттяните хвост, который соединен с концом кишки, чтобы удалить всю кишку.
Поместите вырезанные кишки в центрифужную пробирку объемом 200 микролитров. Добавьте в тюбик 200 микролитров PBS и с помощью пипетки тщательно промойте кишки. С помощью пипетки поместите 100 микролитров PBS на предметное стекло и поместите предметное стекло на предметное стекло и поместите предметное стекло на столик оптического микроскопа.
Используйте ручной аспиратор, чтобы собрать зараженных SRBSDV нимф из стеклянных стаканов и поместить их в 1,5-миллилитровую пробирку, помещенную на лед, чтобы парализовать насекомых. Перенесите парализованную нимфу в буфер объемом 100 микролитров на предметном стекле животом вверх. Отсоедините хвост нимфы, затем зажмите тело насекомого, чтобы аккуратно зафиксировать его, и используйте другую пару, чтобы зажать голову.
Осторожно оттяните голову от тела, сохраняя при этом ее прикрепление к кишечнику, чтобы голова была отделена от тела, но кишка все еще была прикреплена к грудной клетке и животу. Пока пинцет все еще зажимает тело, используйте другую пару, чтобы осторожно двигать головой и постепенно вытаскивать кишку. Отделите кишку от головы, чтобы получить неповрежденную кишку, не повреждая тело.
Поместите иссеченные кишки в трубочку. Добавьте PBS в тюбик и аккуратно пососите, выпустите раствор пипеткой, чтобы тщательно промыть кишки. Подготовьте антитела и монтажную среду, как описано в текстовой рукописи.
Поместите свежеиссеченные и промытые PBS кишки WBPH в 100 микролитров 4% параформальдегида в центрифужную пробирку объемом 200 микролитров при комнатной температуре. Через два часа замените раствор параформальдегида на 200 микролитров PBS. Через 10 минут удалите PBS, чтобы удалить параформальдегид, и повторите этап стирки PBS дважды.
После двух стирок PBS добавьте 200 микролитров неионогенного моющего средства Triton X-100, чтобы пропитать образцы при комнатной температуре. Через 30 минут снимите Triton X-100 и смойте остатки моющего средства тремя 10-минутными стирками с PBS. Разбавьте меченые антитела один к 50 50 50 микролитрами бычьего сывороточного альбумина.
Добавьте разбавленные антитела в пробирку и инкубируйте образцы в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующее утро после удаления антитела смойте остатки разбавителя антител тремя 10-минутными промывками PBS. Разбавьте один микролитр DyLight 633-фаллоидина 50 микролитрами PBS и добавьте 50 микролитров разбавленного фаллоидина в пробирку для двухчасовой инкубации при комнатной температуре.
После удаления фаллоидина тщательно смойте остатки фаллоидина тремя 10-минутными промывками PBS. Поместите каплю монтажного носителя, содержащего DAPI, на предметное стекло микроскопа. Переложите кишки в среду и аккуратно поместите покровное стекло на образец, не образуя пузырьков.
Репрезентативная лазерная сканирующая конфокальная микрофотография иссеченных кишок WBPH у взрослых после мечения фаллоидином показала три среза: переднюю, среднюю и заднюю кишки. Среди них средняя кишка является начальным местом заражения SRBSDV. Монослойная эпителиальная клеточная структура кишечника облегчает изучение клеточной локализации белков насекомых и колокализации белков вирусов и насекомых.
Здесь показаны иссеченные кишки WBPH с мечеными DyLight 488 анти-VAMP-7 и вирионами SRBSDV с мечеными DyLight 549 антителами против SRBSDV. Было показано, что вирионы VAMP-7 и SRBSDV локализуются в цитоплазме, что позволяет предположить, что VAMP-7 может играть роль в передаче вируса in vivo. Пермеабилизированные кишки следует тщательно очищать после инкубации с люцифериновыми конъюгированными антителами для снижения фона и неспецифического связывания.
Это надежный метод просмотра локализации вируса, других патогенов и белков насекомых у насекомых. Это обеспечивает основу для дальнейших исследований взаимосвязи между патогенами и насекомыми.
