Este protocolo pode ser usado para estudar vários movimentos em insetos, funções de proteínas de insetos e interações entre vírus e inseto vetor in vivo. Este método é eficiente e informativo. As estruturas do intestino do inseto e das células auxiliares são claramente visualizadas quando visualizadas com a microscopia confocal de varredura a laser.
Quem demonstrará o procedimento será Lu Zhang, PhD do nosso laboratório. Para começar, transfira insetos não virulíferos de copos de vidro para o vírus anão fresco do sul do arroz, SRBSDV, plantas de arroz infectadas cobertas com uma rede à prova de insetos por um período de acesso de aquisição de vírus de dois dias. Em seguida, colete os insetos em copos de vidro contendo mudas frescas de arroz.
Após dois dias, coletar os insetos dos copos de vidro usando um aspirador manual para dissecção e excisão do intestino. Preparar PBS 0,01 molar, paraformaldeído a 4% e Tritão X-100 a 2%, conforme descrito no manuscrito do texto. Use um pipetter para colocar 100 microlitros de PBS em uma lâmina de vidro e coloque a lâmina no palco de um microscópio óptico.
Use aspirador manual para coletar os adultos infectados SRBSDV dos copos de vidro e colocá-los em um tubo de 1,5 mililitro sobre gelo para paralisar os insetos. Transfira um adulto paralisado para os 100 microlitros de PBS na lâmina com o abdômen para cima. Use uma pinça para prender o corpo e remover a cabeça com outro conjunto de pinças.
Com um conjunto de pinças, prenda os lados do abdome e prenda o ovipositor ou o órgão copulatório da cauda com o outro conjunto, em seguida, puxe cuidadosamente a membrana intersegmentar de um segmento abdominal para expor lentamente o intestino no abdômen. Continue rasgando a membrana e gradualmente retire o intestino completo do abdômen. Puxe suavemente a cauda que está conectada à extremidade do intestino para remover o intestino completo.
Coloque as vísceras excisadas em um tubo de centrífuga de 200 microlitros. Adicione 200 microlitros de PBS ao tubo e use uma pipeta para lavar bem as vísceras. Use um pipetter para colocar 100 microlitros de PBS em uma lâmina de vidro e coloque a lâmina no palco de um microscópio óptico.
Use aspirador manual para coletar as ninfas infectadas pelo SRBSDV de copos de vidro e coloque-as em tubo de 1,5 mililitro colocado no gelo para paralisar os insetos. Transfira uma ninfa paralisada para os 100 microlitros de tampão na lâmina com o abdômen voltado para cima. Desprenda a cauda da ninfa, em seguida, prenda o corpo do inseto para fixá-lo suavemente e use o outro par para prender a cabeça.
Puxe suavemente a cabeça para longe do corpo, mantendo sua fixação ao intestino para que a cabeça esteja desprendida do corpo, mas o intestino ainda está preso ao tórax e ao abdômen. Com a pinça ainda apertando o corpo, use o outro par para mover a cabeça com cuidado e gradualmente puxe o intestino. Separe o intestino da cabeça para obter um intestino intacto sem danificar o corpo.
Coloque as vísceras excisadas em um tubo. Adicione PBS ao tubo e suge suavemente a solução com uma pipeta para lavar bem as vísceras. Preparar os anticorpos e o meio de montagem conforme descrito no manuscrito do texto.
Coloque as vísceras WBPH recém-excisadas e lavadas em PBS em 100 microlitros de paraformaldeído a 4% em um tubo centrífugo de 200 microlitros à temperatura ambiente. Após duas horas, substituir a solução de paraformaldeído por 200 microlitros de PBS. Após 10 minutos, remova o PBS para eliminar qualquer paraformaldeído e repita a etapa de lavagem PBS duas vezes.
Após duas lavagens com PBS, adicionar 200 microlitros de detergente não iônico Triton X-100 para permeabilizar as amostras à temperatura ambiente. Após 30 minutos, remova o Triton X-100 e lave qualquer detergente restante com três lavagens de 10 minutos com PBS. Diluir os anticorpos marcados de um a 50 com 50 microlitros de albumina de soro de touro.
Adicione os anticorpos diluídos ao tubo e incube as amostras durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã após a remoção do anticorpo, lave o diluente de anticorpos restante com três lavagens de 10 minutos com PBS. Diluir um microlitro de DyLight 633-Phalloidin com 50 microlitros de PBS e adicionar 50 microlitros de faloidina diluída ao tubo para uma incubação de duas horas à temperatura ambiente.
Depois de remover a faloidina, lave bem a faloidina restante com três lavagens de 10 minutos com PBS. Coloque uma gota de meio de montagem contendo DAPI em uma lâmina de microscópio. Transfira as vísceras para o meio e coloque suavemente o vidro de cobertura sobre a amostra sem criar bolhas.
A micrografia confocal representativa de varredura a laser de intestinos WBPH excisados de adultos após marcação com faloidina mostrou três seções: intestino anterior, intestino médio e intestino posterior. Dentre estes, o intestino médio é o sítio inicial de infecção do SRBSDV. A estrutura celular epitelial monocamada do intestino facilita o estudo da localização celular de proteínas de insetos e colocalização de proteínas virais e de insetos.
Intestinos WBPH excisados com DyLight 488 marcado anti-VAMP-7 e virions SRBSDV com anticorpo anti-SRBSDV marcado com DyLight 549 são mostrados aqui. Os virions VAMP-7 e SRBSDV foram mostrados para co-localizar no citoplasma, sugerindo que VAMP-7 pode desempenhar um papel na transmissão do vírus in vivo. Os intestinos permeabilizados devem ser cuidadosamente limpos após a incubação com anticorpos conjugados de luciferina para reduzir o fundo e a ligação inespecífica.
Este é um método confiável para ver a localização de vírus, outros patógenos e proteínas de insetos em insetos. Ele fornece a base para novos estudos da relação entre patógenos e insetos.
