이 프로토콜은 곤충의 다양한 움직임, 곤충 단백질의 기능, 생체 내에서 바이러스와 벡터 곤충 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 효율적이고 유익합니다. 곤충 내장과 보조 세포의 구조는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 볼 때 명확하게 시각화됩니다.
이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 Lu Zhang 박사가 될 것입니다. 시작하려면 유리 비커에서 독성이 없는 곤충을 신선한 남부 쌀 검은 줄무늬 난쟁이 바이러스, SRBSDV, 감염된 벼로 옮기고 이틀 간의 바이러스 획득 접근 기간 동안 방충망으로 덮여 있습니다. 그런 다음 신선한 쌀 묘목이 들어있는 유리 비커에 곤충을 모으십시오.
이틀 후, 장의 해부 및 절제를위한 수동 흡인기기를 사용하여 유리 비커에서 곤충을 수집하십시오. 텍스트 원고에 설명된 대로 0.01몰 PBS, 4% 파라포름알데히드 및 2% 트리톤 X-100을 준비합니다. 피펫터를 사용하여 100마이크로리터의 PBS를 유리 슬라이드에 놓고 슬라이드를 광학 현미경의 무대에 놓습니다.
수동 흡인기 사용 유리 비커에서 SRBSDV 감염 성인을 수집하고 얼음 위의 1.5 밀리리터 튜브에 넣어 곤충을 마비시킵니다. 마비 된 성인을 복부를 위로 올린 상태에서 슬라이드의 100 마이크로 리터의 PBS로 옮깁니다. 핀셋을 사용하여 본체를 고정하고 다른 핀셋 세트로 머리를 제거합니다.
한 세트의 핀셋으로 복부의 측면을 고정하고 다른 세트로 꼬리의 산란관 또는 교합 기관을 고정시킨 다음 한 복부 세그먼트의 분절 간 막을 조심스럽게 당겨 복부의 내장을 천천히 노출시킵니다. 막을 계속 찢어 내고 복부에서 완전한 내장을 서서히 빼냅니다. 내장 끝에 연결된 꼬리를 부드럽게 당겨 전체 내장을 제거합니다.
절제된 내장을 200마이크로리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 200마이크로리터의 PBS를 튜브에 넣고 피펫을 사용하여 내장을 철저히 씻습니다. 피펫터를 사용하여 100마이크로리터의 PBS를 유리 슬라이드에 놓고 슬라이드를 광학 현미경의 무대에 놓습니다.
수동 흡인기로 SRBSDV 감염 님프를 유리 비커에서 채취하여 얼음 위에 놓인 1.5 밀리리터 튜브에 넣어 곤충을 마비시킵니다. 마비 된 님프를 복부가 위를 향하게하여 슬라이드의 100 마이크로 리터의 완충액으로 옮깁니다. 님프의 꼬리를 떼어 낸 다음 곤충 몸체를 단단히 고정하여 부드럽게 고정하고 다른 쌍을 사용하여 머리를 고정하십시오.
머리가 몸에서 분리되더라도 내장은 여전히 흉부와 복부에 붙어 있도록 장에 부착된 상태를 유지하면서 머리를 몸에서 부드럽게 잡아당깁니다. 핀셋이 여전히 몸을 고정하고 있는 상태에서 다른 쌍을 사용하여 머리를 조심스럽게 움직이고 점차적으로 내장을 빼냅니다. 몸을 손상시키지 않고 온전한 내장을 얻기 위해 머리에서 내장을 분리하십시오.
절제된 내장을 튜브에 넣습니다. PBS를 튜브에 넣고 피펫으로 용액을 부드럽게 빨아들여 내장을 철저히 씻습니다. 본문 원고에 기술된 바와 같이 항체와 마운팅 배지를 준비한다.
갓 절제하고 PBS 세척한 WBPH 내장을 실온에서 200마이크로리터 원심분리기 튜브에 100마이크로리터의 4% 파라포름알데히드에 넣습니다. 2시간 후, 파라포름알데히드 용액을 200 마이크로리터의 PBS로 교체한다. 10분 후, PBS를 제거하여 파라포름알데히드를 제거하고 PBS 세척 단계를 두 번 반복한다.
PBS 세척 2회 후 200마이크로리터의 비이온성 세제 Triton X-100을 첨가하여 샘플을 실온에서 투과시킵니다. 30분 후 Triton X-100을 제거하고 PBS로 10분 세척 3회 세척하여 남아 있는 세제를 씻어냅니다. 표지된 항체 1 내지 50을 50 마이크로리터의 황소 혈청 알부민으로 희석한다.
희석된 항체를 튜브에 넣고 섭씨 4도에서 밤새 샘플을 배양합니다. 항체를 제거한 다음날 아침에, PBS로 10분간 3회 세척하여 남아있는 항체 희석액을 씻어낸다. 1마이크로리터의 DyLight 633-팔로이딘을 50마이크로리터의 PBS로 희석하고 50마이크로리터의 희석된 팔로이딘을 튜브에 추가하여 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
팔로이딘을 제거한 후 PBS로 10분 동안 3회 세척하여 남은 팔로이딘을 철저히 씻어냅니다. DAPI가 포함된 장착 매체 한 방울을 현미경 슬라이드에 놓습니다. 내장을 배지로 옮기고 기포를 생성하지 않고 샘플 위에 커버 유리를 부드럽게 놓습니다.
팔로이딘으로 표지한 후 성인의 절제된 WBPH 내장의 대표적인 레이저 스캐닝 공초점 현미경 사진은 전장, 중장 및 후장의 세 부분을 보여주었습니다. 이 중 중장은 SRBSDV의 초기 감염 부위입니다. 장의 단층 상피 세포 구조는 곤충 단백질의 세포 국소화 및 바이러스 및 곤충 단백질의 공동 국소화 연구를 용이하게합니다.
DyLight 488 표지 항-VAMP-7 및 DyLight 549 표지 항-SRBSDV 항체가 포함된 SRBSDV 비리온이 포함된 절제된 WBPH 내장이 여기에 표시됩니다. VAMP-7 및 SRBSDV 비리온은 세포질에서 공동 국소화되는 것으로 나타났으며, 이는 VAMP-7이 생체 내에서 바이러스 전파에 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 투과화된 내장은 루시페린 접합 항체로 배양한 후 철저히 세척하여 배경과 비특이적 결합을 줄여야 합니다.
이것은 곤충에서 바이러스, 기타 병원체 및 곤충 단백질의 국소화를 볼 수 있는 신뢰할 수 있는 방법입니다. 그것은 병원체와 곤충 사이의 관계에 대한 추가 연구의 기초를 제공합니다.
