Этот протокол помогает изолировать рециркулирующие эндосомы, содержащие фракцию, из трансфектированных клеток млекопитающих, чтобы облегчить расследование незаконного оборота белка через эндоцитарный трафик. Этот метод прост в обращении и применим как к образцам тканей, так и к образцам клеток. Продемонстрировать процедуру будет мисс Чжай Ю Ци, аспирант из лаборатории доктора Лао.
Для начала нанесите 2 раза по 10 на 6 клеток в 100-миллиметровую культуральную чашку. На следующий день трансфектируют клетки липофектамином согласно инструкции производителя. Чтобы собрать клетки, выбросьте культуральную среду через 48 часов после трансфекции и дважды промыть клетки ледяным PBS.
Затем добавьте один миллилитр ледяного PBS, дополненного коктейлем ингибитора протеазы 0,5X в коктейле ингибитора фосфатазы 0,5X. Затем, используя клеточный скребок, соберите ячейки и перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую центрифужную трубку. ячейки центрифугированием с использованием поворотного ротора ковша.
Отбросьте супернатант и осторожно повторно суспендируйте гранулу ячейки в пяти миллилитрах буфера гомогенизации. Соберите клетки снова путем центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу клетки в одном миллилитре буфера гомогенизации. Гомогенизируйте клетки гомогенизатором Dounce, используя от 15 до 20 ударов.
Затем переложите гомогонат на двухмиллилитровую центрифугированную трубку. Добавьте к гомогонату 700 микролитров буфера гомогенизации. Затем раскрутите разбавленный омогонат и соберите 1,5 миллилитра супернатанта.
Снова вращайте собранный супернатант, затем соберите 1,4 миллилитра супернатанта и пометьте его как постядерный супернатант. Чтобы подготовить колонку градиента плотности, переложите 1,2 миллилитра постядерного супернатанта в ультрацентрифужную трубку. Затем к образцу добавляют один миллилитр 62%-ного раствора сахарозы и хорошо перемешивают путем бережного пипетирования.
Затем осторожно добавляют 3,3 миллилитра 35%-ного раствора сахарозы поверх образца, а затем 2,2 миллилитра 25%-ного раствора сахарозы поверх 35%-ного раствора сахарозы. Наконец, заполните трубку ультрацентрифуги сверху буфером гомогенизации. Центрифугируйте столбец градиента плотности и аккуратно соберите 12 фракций по 1 миллилитру каждая, начиная с вершины градиента.
Далее разбавляют все фракции одним миллилитром буфера разбавления и центрифугируют разбавленные образцы. После центрифугирования аспирируйте супернатант и добавьте 50 микролитров буфера образца 1X для сбора фракций. Рециркулирующий эндосомный маркер Rab11 был обнаружен в седьмой фракции.
Другие субклеточные маркеры, включая бета COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 и Lamp1, также были исследованы. Положительный сигнал EEA1 был также обнаружен в седьмой фракции. Измеренные полосовые интенсивности GAPDH, Cox IV и Rab11 как в седьмой фракции, так и в постядерном супернатанте показаны здесь.
После транссекции клеток HEC293 с ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L или ELMO1 ARF6Q67L FE65 не было обнаружено никаких изменений в распределении ELMO1 с гиперэкспрессией ARF6Q67L и FE65. Уровень ELMO1 в седьмой фракции сравнивали между различными трансфекциями и обнаружили повышенный после котрансфекции ARF6Q67L. Дальнейшее увеличение наблюдалось при совместной экспрессии ARF6Q67L и FE65.
И наоборот, выбивание FE65 уменьшило обогащение Elmo1, опосредованное ARF6, в седьмой фракции. Полученная фракция может быть использована для последующего анализа. Например, вестерн-блоттинг для визуализации изменений уровня белка во фракции.
