Этот протокол может захватывать кинетику в реальном времени на уровне одной клетки. Мы можем измерять отдельные параметры клеток в ответ на ВИЧ-инфекцию и связывать ранние сигнальные события с отсроченными этапами жизненного цикла вируса. Это интегрированная масштабируемая альтернатива традиционным методам визуализации с использованием новой оптофлюидной платформы для одноклеточной сортировки, культивирования, визуализации и автоматизации программного обеспечения.
Это первый установленный метод для нанофлюидной, высокопроизводительной, продольной одноклеточной культуры и визуализации. Этот метод может быть широко принят для изучения кинетики клеточной сигнализации и динамических молекулярных взаимодействий в различных болезненных состояниях. Визуальная демонстрация этого метода важна для передачи того, как проводится эксперимент, как ячейки оптически сортируются в ручки и как настраивать инфузии через чип.
Для начала приготовьте свежий раствор Fluo-4 AM, добавив 25 микролитров концентрированного моющего растворителя 100X и 2,5 микролитра 1, 000X Fluo-4 AM в 1,5 миллилитровую трубку, затем вихрь для смешивания. Пипетка 2,5 миллилитра питательной среды в загрузочный раствор и инвертируется для смешивания. Центрифугируют два миллиона ячеек МТ-4 в 500 раз G в течение трех минут, затем удаляют жижу и повторно суспендируют гранулу в двух миллилитрах подготовленного загрузочного раствора Fluo-4 AM.
Пипетка повторно подвешивает клетки в 35-миллиметровую чашку Петри. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15-30 минут, затем инкубировать еще 15-30 минут при комнатной температуре. Перенесите клеточную суспензию в трубку центрифуги и центрифугируют ячейки в 500 раз G в течение трех минут, затем удалите супернатант.
Повторно суспендируют гранулу клетки путем пипетки в одном миллилитрах питательной среды и центрифуги в 500 раз G в течение трех минут для промывки. Повторно суспендируют клеточную гранулу путем пипетки в культуральная среда в концентрации двух миллионов клеток на миллилитр в течение не менее 50 микролитров. Чтобы приготовить чип с смачивающим раствором, который облегчает выемку ячейки, загрузите трубки центрифуги, содержащие два миллилитра смачивающего раствора и 50 миллилитров деионизированной воды, на инструмент с новым оптофлюидным чипом и запустите функцию мокрого чипа, которая заположит чип смачивающим раствором.
Инкубируют чип при 50 градусах Цельсия и трижды промывайте чип водой. После промывки водой промывки промывки чипа тремя циклами по 250 микролитров питательной среды. Дополняйте клеточную суспензию с предыдущей ступени одним на 100 частей моющего средства F127 перед загрузкой, чтобы уменьшить вероятность прилипания клеток к каналам чипа.
Используйте иглу экспорта инструмента для импорта ячеек из 1,5-миллилитровой центрифужной трубки с операцией загрузки и импортом небольшого объема для пятимиллитрового пакета ячейки. Перьевые ячейки, использующие оптимизированное оптоэлектронное позиционирование или напряжение OEP 4,3 вольта и скорость клетки пять микрометров в секунду с помощью функции автоматического пера, которая автоматически обнаруживает отдельные ячейки, окружает их клеткой OEP и перемещает их в ближайшую ручку. Если интересующие ячейки остаются после автоматического написания, используйте функцию ручного пера для выбора целевых ячеек и целевого пера.
После завершения написания промывайте чип тремя циклами по 250 микролитров питательной среды, чтобы очистить оставшиеся неоткопимые клетки от чипа. После написания клеток получите флуоресцентные изображения клеток в каналах FITC, Texas Red и DAPI для измерения базового уровня Fluo-4, mCherry и автофлуоресценции. Вливать ВИЧ-1 в микрочип в концентрации 13 нанограммов ВИЧ-1 NLCI на два миллиона клеток, медленно пипетируя суспензию в чип через экспортную иглу.
Сразу после добавления ВИЧ-1 многократно получать изображения в каналах FITC и DAPI в течение 10-минутного временного курса. Получайте изображения в каналах Texas Red и DAPI через один, два, три и четыре дня после заражения. Эта методология использовалась для идентификации и кластеризации ВИЧ-инфицированных и неинфицированных клеток с помощью измерения mCherry.
Клетки с изменением сигнала mCherry больше или ниже средней интенсивности флуоресцентности 40 000 были сгруппированы в популяцию mCherry high или mCherry low соответственно. Эти кластеры были проанализированы на кинетику притока кальция путем измерения внутриклеточного кальция с использованием флуоресценции Fluo-4 многократно в течение девяти минут времени, что продемонстрировало ранний приток кальция в ВИЧ-инфицированные клетки. Наблюдалась значительная положительная корреляция между притоком кальция и цветением мвышни.
При попытке этой процедуры важно не забывать начинать с клеток в пределах экспоненциального диапазона роста как для производства вируса, так и для инфекции, потому что разросшиеся клетки приведут к резкому снижению сигнала от этого анализа. Работа с ВИЧ-1 может быть опасной. Поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует принимать методы BSL-2, указанные в стандарте OSHA bloodborne Pathogen Standard.
Этот метод интересен, потому что он позволит нам изучать одноклеточные фенотипические или транскрипционные изменения в контролируемых условиях. Это имеет широкий потенциал для корреляции влияния стимулов на молекулярные пути во многих типах клеток.
