Bu protokol tek hücreli düzeyde gerçek zamanlı kinetik yakalayabilir. HIV enfeksiyonuna yanıt olarak bireysel hücre parametrelerini ölçebilir ve erken sinyal olaylarını viral yaşam döngüsünün gecikmiş adımlarıyla ilişkilendirebiliriz. Bu, tek hücreli sıralama, kültleştirme, görüntüleme ve yazılım otomasyonu için yeni bir optofluidik platform kullanan geleneksel görüntüleme yöntemlerine entegre ölçeklenebilir bir alternatiftir.
Bu nanoakışkan, yüksek verimli, boyuna tek hücreli kültür ve görüntüleme için ilk kurulan yöntemdir. Bu teknik, çeşitli hastalık durumlarında hücresel sinyal kinetiği ve dinamik moleküler etkileşimleri incelemek için yaygın olarak benimsenebilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, deneyin nasıl ayarlandırılacağını, hücrelerin optik olarak kalemlere nasıl sıralandırılacağını ve çip aracılığıyla infüzyonların nasıl kurulacağini iletmek için önemlidir.
Başlamak için, 1,5 mililitrelik bir tüpe 25 mikrolitre 100X konsantre deterjan çözücü ve 1.000X Fluo-4 AM'nin 2,5 mikrolitresini ekleyerek taze Fluo-4 yükleme çözeltisi hazırlayın, ardından karıştırmak için girdap ekleyin. Pipet 2,5 mililitre kültür ortamı yükleme çözeltisine ve karıştırmak için ters çevirin. Üç dakika boyunca 500 kez G'de iki milyon MT-4 hücresini santrifüjleyin, ardından medyayı çıkarın ve peletin hazırlanan Fluo-4 yükleme çözeltisinin iki mililitresinde yeniden kullanın.
Pipet hücreleri 35 milimetrelik petri kabına yeniden astı. 37 santigrat derecede 15 ila 30 dakika kuluçkaya yatırın, ardından oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika daha kuluçkaya yatırın. Hücre süspansiyonu bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri üç dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin, ardından üstnatantı çıkarın.
Hücre peletini kültür ortamının bir mililitresinde pipetleme ve üç dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yaparak yeniden ıslatın. En az 50 mikrolitre için mililitre başına iki milyon hücre konsantrasyonunda kültür ortamında pipetleme yaparak hücre peletini yeniden biriktirin. Hücre penelatmasını kolaylaştıran ıslatma solüsyonu ile bir çip hazırlamak için, iki mililitre ıslatma çözeltisi ve 50 mililitre deiyonize su içeren santrifüj tüplerini yeni bir optofluidik çip ile cihaza yükleyin ve çipi ıslatma çözeltisi ile dolduracak ıslak talaş işlevini çalıştırın.
Çipi 50 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve çipi üç kez suyla yıkayın. Su yıkama yapıldıktan sonra, çipi 250 mikrolitrelik üç kültür ortamı döngüsüyle yıkayın. Hücrelerin çip kanallarına yapışma olasılığını azaltmak için yüklemeden önce her 100 parçadan F127 deterjanı ile önceki adımdan hücre süspansiyonu takviyesi.
Yük işlemi ile 1,5 mililitre santrifüj tüpünden hücre ithal etmek ve beş mikrolitre hücre paketi hacmi için küçük hacimli içe aktarmak için cihaz dışa aktarma iğnesini kullanın. Tek hücreleri otomatik olarak algılayacak, bir OEP kafesi ile çevreleyecek ve yakındaki bir kaleme taşıyacak otomatik kalem işlevini kullanarak optimize edilmiş bir optoelektronik konumlandırma veya saniyede beş mikrometre kafes hızına sahip bir optoelektronik konumlandırma veya OEP voltajı kullanan kalem hücreleri. İlgi çekici hücreler otomatik kaleme almanın ardından kalırsa, hedef hücreleri ve hedef kalemi seçmek için el ile kalem işlevini kullanın.
Peneleme tamamlandıktan sonra, kalan unpenned hücreleri çipten temizlemek için çipi 250 mikrolitrelik üç kültür ortamı döngüsüyle yıkayın. Hücreleri kaleme aldıktan sonra, temel Fluo-4, mCherry ve otofluoresansı ölçmek için FITC, Texas Red ve DAPI kanallarındaki hücrelerin floresan görüntülerini elde edin. Hiv-1'i mikroçip içine iki milyon hücre başına 13 nanogram HIV-1 NLCI konsantrasyonunda, süspansiyonu ihracat iğnesi aracılığıyla yavaşça çipe pipetleterek demleyin.
HIV-1 ilavesinin hemen ardından FITC ve DAPI kanallarında 10 dakikalık bir zaman diliminde tekrar tekrar görüntü elde edin. Texas Red ve DAPI kanallarında enfeksiyon sonrası bir, iki, üç ve dört günlük görüntüler elde edin. Bu metodoloji, mCherry ölçümü ile HIV ile enfekte ve enfekte olmayan hücrelerin tanımlanması ve kümelenmesi için kullanılmıştır.
mCherry sinyalinde 40.000 ortalama floresan yoğunluğundan daha büyük veya daha düşük bir değişime sahip hücreler sırasıyla mCherry yüksek veya mCherry düşük popülasyonunda kümelenmiştir. Bu kümeler, HIV ile enfekte olmuş hücrelerde erken kalsiyum akını gösteren dokuz dakikalık bir zaman kursunda Fluo-4 floresan kullanılarak hücre içi kalsiyum ölçümü yapılarak kalsiyum akını kinetiği açısından analiz edildi. Kalsiyum akını ile mCherry florescence arasında anlamlı pozitif korelasyon gözlendi.
Bu prosedürü denerken, hem virüs üretimi hem de enfeksiyon için üstel büyüme aralığındaki hücrelerle başlamayı hatırlamak önemlidir, çünkü aşırı büyümüş hücreler bu testten gelen sinyalde önemli bir azalmaya neden olacaktır. HIV-1 ile çalışmak tehlikeli olabilir. Bu nedenle, bu işlem yapılırken OSHA Kan Bazlı Patojen Standardında belirtilen BSL-2 uygulamaları her zaman alınmalıdır.
Bu teknik heyecan vericidir, çünkü kontrollü koşullar altında tek hücreli fenotipik veya transkripsiyonik değişiklikleri incelememize izin verecektir. Bu, uyaranların birçok hücre tipinde moleküler yollar üzerindeki etkisini ilişkilendiren geniş bir potansiyele sahiptir.
