Ce protocole peut capturer la cinétique en temps réel au niveau d’une seule cellule. Nous pouvons mesurer les paramètres cellulaires individuels en réponse à l’infection par le VIH et associer les événements de signalisation précoce aux étapes retardées du cycle de vie viral. Il s’agit d’une alternative évolutive intégrée aux méthodes d’imagerie traditionnelles utilisant une nouvelle plate-forme optofluidique pour le tri unicellulaire, la culture, l’imagerie et l’automatisation logicielle.
Il s’agit de la première méthode établie pour la culture et l’imagerie unicellulaires nanofluidiques, à haut débit et longitudinales. Cette technique peut être largement adoptée pour étudier la cinétique de signalisation cellulaire et les interactions moléculaires dynamiques dans une variété d’états pathologiques. La démonstration visuelle de cette méthode est importante pour indiquer comment l’expérience est mise en place, comment les cellules sont triées optiquement dans des stylos et comment configurer des infusions à travers la puce.
Pour commencer, préparez la solution fraîche de chargement Fluo-4 AM en ajoutant 25 microlitres de solvant détergent concentré 100X et 2,5 microlitres de 1 000X Fluo-4 AM à un tube de 1,5 millilitre, puis vortex à mélanger. Pipeter 2,5 millilitres de milieux de culture dans la solution de chargement et inverser pour mélanger. Centrifuger deux millions de cellules MT-4 à 500 fois G pendant trois minutes, puis retirer le milieu et ressusciter la pastille dans deux millilitres de la solution de chargement Fluo-4 AM préparée.
Pipette re-suspended cells into a 35 millimètres Petri dish. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes, puis incuber pendant 15 à 30 minutes supplémentaires à température ambiante. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger et centrifuger les cellules à 500 fois G pendant trois minutes, puis retirer le surnageant.
Ressusciter la pastille cellulaire en pipetant dans un millilitre du milieu de culture et centrifuger à 500 fois G pendant trois minutes pour laver. Ressusciter le culot cellulaire par pipetage dans le milieu de culture à une concentration de deux millions de cellules par millilitre pour au moins 50 microlitres. Pour préparer une puce avec la solution mouillante, ce qui facilite l’ensemencement des cellules, chargez des tubes à centrifuger contenant deux millilitres de solution mouillante et 50 millilitres d’eau désionisée sur l’instrument avec une nouvelle puce optofluidique et exécutez la fonction de puce humide qui inondera la puce avec la solution mouillante.
Incuber la puce à 50 degrés Celsius et rincer la puce avec de l’eau trois fois. Une fois le rinçage à l’eau terminé, rincez la puce avec trois cycles de 250 microlitres de milieux de culture. Complétez la suspension cellulaire de l’étape précédente avec un soluté détergent F127 pour 100 parties avant le chargement afin de réduire la probabilité que les cellules collent aux canaux de la puce.
Utilisez l’aiguille d’exportation de l’instrument pour importer des cellules à partir d’un tube de centrifugation de 1,5 millilitre avec l’opération de charge et l’importation de petit volume pour un volume d’emballage de cinq cellules microlitres. Cellules de stylo utilisant un positionnement optoélectronique optimisé ou une tension OEP de 4,3 volts et une vitesse de cage de cinq micromètres par seconde à l’aide de la fonction de stylo automatique, qui détectera automatiquement les cellules individuelles, les entourera d’une cage OEP et les déplacera dans un stylo à proximité. Si les cellules d’intérêt restent après la saisie automatique, utilisez la fonction de stylet manuel pour sélectionner les cellules cibles et un stylet de destination.
Une fois l’enclos terminé, rincez la puce avec trois cycles de 250 microlitres de milieux de culture pour éliminer toutes les cellules nonpendées restantes de la puce. Après avoir penning des cellules, obtenir des images fluorescentes des cellules dans les canaux FITC, Texas Red et DAPI pour mesurer la ligne de base Fluo-4, mCherry, et l’autofluorescence. Infuser le VIH-1 dans la micropuce à une concentration de 13 nanogrammes de NLCI du VIH-1 par deux millions de cellules en canalisant lentement la suspension dans la puce à travers l’aiguille d’exportation.
Immédiatement après l’ajout du VIH-1, obtenez à plusieurs reprises des images dans les canaux FITC et DAPI sur une durée de 10 minutes. Obtenez des images dans les canaux Texas Red et DAPI à un, deux, trois et quatre jours après l’infection. Cette méthodologie a été utilisée pour l’identification et le regroupement des cellules infectées et non infectées par le VIH par mesure mCherry.
Les cellules avec un changement de signal de mCherry supérieur ou inférieur à 40.000 intensité fluorescente moyenne ont été regroupées dans la population mCherry haute ou mCherry basse respectivement. Ces faisceaux ont été analysés pour la cinétique d’afflux de calcium en mesurant le calcium intracellulaire utilisant la fluorescence Fluo-4 à plusieurs reprises sur un cours de temps de neuf minutes, qui a démontré l’afflux tôt de calcium dans les cellules HIV-infectées. On a observé une corrélation positive significative entre l’afflux de calcium et la florescence de mCherry.
Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de commencer par les cellules dans la plage de croissance exponentielle pour la production de virus et l’infection, car les cellules envahies par la prolifération entraîneront une diminution spectaculaire du signal de ce test. Travailler avec le VIH-1 peut être dangereux. Par conséquent, les pratiques BSL-2 indiquées dans la norme osha sur les agents pathogènes à diffusion hématogénée doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
Cette technique est passionnante car elle nous permettra d’étudier les changements phénotypiques ou transcriptionnels unicellulaires dans des conditions contrôlées. Cela a un large potentiel pour corréler l’impact des stimuli sur les voies moléculaires dans de nombreux types de cellules.
