Il FRET a singola molecola può catturare le dinamiche che si verificano a distanze nanometriche, che è la scala giusta per il processo di biosintesi delle proteine ribosomiali. Il ribosoma funziona coordinando allostericamente più fattori e componenti, il che è intrinsecamente disomogeneo. Il metodo a singola molecola può tracciare ogni ribosoma senza essere limitato da questo effetto medio disomogeneo.
Questo metodo rivelerà come gli antibiotici inibiscono la funzione del ribosoma per sviluppare nuovi farmaci verso le infezioni batteriche resistenti ai farmaci. Iniziare preparando il PRE mescolando la miscela EFTU, NOG e PAG di inizio al rapporto di uno a due a due a 37 gradi Celsius per due minuti. Dopo l'incubazione, purificare il PRE utilizzando l'ultracentrifugazione del cuscino di saccarosio molare 1.1 durante la notte a 100.000 volte G.Preparare il POST mescolando la miscela EFTU, WG e PHE di avvio in un rapporto di uno a due a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Dopo l'incubazione, purificare il POST utilizzando l'ultracentrifugazione del cuscino di saccarosio molare 1.1 durante la notte a 100.000 volte G.Pulire i vetrini del microscopio contenenti sei paia di fori di un millimetro di diametro e il numero 1.5 coperture in vetro del microscopio. Cuocere i vetrini puliti e i coverslip a 300 gradi Celsius per tre ore, quindi rivestire il coverslip con aminosalina. In una cappa laminare pulita, posare un coperchio piatto sulla superficie.
Far cadere con attenzione 60 microlitri di soluzione PEG sul bordo superiore, quindi posare un altro coverslip sopra di esso, lasciando che l'effetto capillare diffonda la soluzione tra di loro assicurando che non si formino bolle. Ripeti questi passaggi per altre due paia di coverslip. Conservare queste coperture in una scatola vuota piena d'acqua e incubarle per tre ore al buio.
Dopo tre ore, separare i coperchi, risciacquare con acqua in tre crogioli consecutivi e spurgare con un flusso di azoto secco. Tirare le punte affilate delle pipette attraverso i fori sulle diapositive di vetro fino a quando non si adattano saldamente. Raschiare le estremità affilate fino a quando non sono completamente piatte con la superficie del vetro, quindi tagliare un nastro biadesivo con il motivo del canale su di esso.
Attaccare le diapositive di vetro sul lato piatto. Attaccare la copertina rivestita sul nastro biadesivo e premere su di essa per sigillare saldamente la camera del campione, assicurandosi che il lato rivestito sia rivolto verso l'interno. Accendere il computer e l'interruttore del microscopio.
Avviare l'interfaccia di controllo laser e accendere il laser. Premere il pulsante di attivazione sulla scatola di controllo laser per riscaldare il laser. Accendere le telecamere, quindi avviare il programma software associato al microscopio.
Fare clic sull'otturatore superiore spento e fare clic sulla lampada accesa. Preparare il TAM10 con il buffer Tween aggiungendo 10 microlitri del 5% di Tween-20 in un millilitro di buffer TAM10. Preparare la soluzione deossidica pesando tre milligrammi di glucosio ossidasi in un piccolo tubo di microcentrifuga e aggiungere 45 microlitri di catalasi ad esso.
Ruotare delicatamente il tubo per sciogliere il solido. Ruotare a 20.000 volte G in una microcentrifuga per un minuto e prendere il surnatante. Preparare la soluzione di glucosio al 30%, la soluzione di Trolox 200 millimolare e 0,5 milligrammi per millilitro di soluzione di streptavitina seguendo le istruzioni nel manoscritto di testo.
Aggiungi una goccia di olio per immagini all'obiettivo del tappeto erboso. Metti le camere campione sull'obiettivo. Riempire la camera con 10 microlitri di soluzione di streptavitina e attendere un minuto.
Lavare la camera con 30 microlitri di TAM10 con tampone Tween, raccogliendo la soluzione run-through con una carta da filtro piegata. Attendere un minuto dopo il lavaggio. Diluire i complessi di ribosomi PRE o POST a concentrazioni nanomolari di 10-15 con TAM10 con tampone di Tween.
Caricare 20 microlitri del campione di ribosoma nel canale e attendere due minuti. Realizzare il buffer di imaging utilizzando 50 microlitri di tampone TAM10 e 0,5 microlitri ciascuno di deossiglucosio e soluzione Trolox. Mescolali bene.
Lavare la camera con 30 millilitri del buffer di imaging. Impostare la fotocamera per l'acquisizione delle immagini. Fare clic sull'otturatore superiore acceso e spegnere la lampada.
Avviare l'acquisizione della fotocamera e diffondere le immagini in tre finestre che rappresentano due singole telecamere e la sovrapposizione. Nel menu acquisisci, selezionare cattura timelapse, quindi fare clic su acquisisci automaticamente. Impostare il nome file appropriato, il percorso del file e il numero di cicli e fare clic su Esegui ora.
Chiudere la finestra pop-up una volta completata l'acquisizione dell'immagine e quindi aprire il file ND acquisito. Fai clic su ROI, semplice editor ROI e scegli il cerchio delle opzioni. Seleziona il ROI sull'immagine e fai clic su Fine quando è completato.
Fare clic su misurazione, misurazione del tempo per mostrare i dati come grafico o foglio di calcolo. Aprire la scheda di esportazione per impostare i parametri di esportazione, quindi fare clic su Esporta per salvare le intensità. Infine, apri il file che è stato esportato utilizzando un'applicazione adatta.
La distanza dal residuo di etichettatura L27 al tRNA del sito A o del sito P è rispettivamente di 61 o 52 angstrom, corrispondente all'efficienza FRET di 0,47 e 0,65. Le intensità di florescenza dai canali donatore e accettore sono state recuperate e tracciate come timelapse. Dopo lo sbiancamento del donatore, entrambe le tracce si sono avvicinate alla linea di base perché nessuna eccitazione poteva verificarsi direttamente sull'accettore.
Dopo lo sbiancamento dell'accettore, l'intensità del donatore è aumentata perché meno vie di reazione hanno dissipato l'energia di eccitazione. I singoli ribosomi hanno mostrato fluttuazioni diverse a causa del movimento oscillante dei tRNA, che ha causato fluttuazioni di distanza verso l'L27. Altri metodi come puromicina, saggio, saggio toeprinting e specifiche di massa sono complementari al metodo FRET a singola molecola e rivelano maggiori dettagli sulla sintesi proteica.
Il FRET a singola molecola ha un'ampia applicazione perché molti processi biologici avvengono nell'intervallo nanometrico e in tempi di millisecondi. Etichettando i coloranti appropriati nelle posizioni corrette, è possibile rivelare molte altre dinamiche.
