Einzelmolekül-FRET kann Dynamiken erfassen, die in Nanometerentfernungen stattfinden, was die richtige Skala für den ribosomalen Proteinbiosyntheseprozess ist. Ribosomen arbeiten, indem es mehrere Faktoren und Komponenten allosterisch koordiniert, was intrinsisch inhomogen ist. Die Einzelmolekülmethode kann jedes Ribosom verfolgen, ohne durch diesen inhomogenen Durchschnittseffekt eingeschränkt zu werden.
Diese Methode wird zeigen, wie Antibiotika die Ribosomenfunktion hemmen, um neue Medikamente gegen arzneimittelresistente bakterielle Infektionen zu entwickeln. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des PRE, indem Sie die Initiierungsmischung EFTU, NOG und PAG im Verhältnis von eins zu zwei zu zwei bei 37 Grad Celsius für zwei Minuten mischen. Reinigen Sie nach der Inkubation den PRE mit 1,1 molarer Saccharosekissen-Ultrazentrifugation über Nacht bei 100.000 mal G.Bereiten Sie den POST vor, indem Sie die Initiationsmischung EFTU, WG und PHE in einem Verhältnis von eins zu zwei zu zwei bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten mischen.
Reinigen Sie den POST nach der Inkubation mit 1,1 molarer Saccharosekissen-Ultrazentrifugation über Nacht bei 100.000-fach G.Reinigen Sie die Mikroskopglasobjektträger mit sechs Löcherpaaren mit einem Durchmesser von einem Millimeter und den Mikroskopglasabdeckungen Nummer 1,5. Die sauberen Slides und Deckschichten bei 300 Grad Celsius drei Stunden lang backen und anschließend den Coverslip mit Aminosaline beschichten. Legen Sie in einer sauberen laminaren Kapuze einen Deckdeckel flach auf die Oberfläche.
Lassen Sie vorsichtig 60 Mikroliter PEG-Lösung auf die Oberkante fallen, legen Sie dann einen weiteren Deckslip darauf, so dass der Kapillareffekt die Lösung zwischen ihnen verteilt, um sicherzustellen, dass keine Blasen gebildet werden. Wiederholen Sie diese Schritte für zwei weitere Paar Coverlips. Bewahren Sie diese Coverlips in einer leeren, mit Wasser gefüllten Tipbox auf und inkubieren Sie sie drei Stunden lang im Dunkeln.
Nach drei Stunden die Abdeckungslippen trennen, in drei aufeinanderfolgenden Tiegeln mit Wasser abspülen und mit einem trockenen Stickstoffstrom reinigen. Ziehen Sie scharfe Pipettenspitzen durch die Löcher auf den Glasschlitten, bis sie fest anliegen. Kratzen Sie die scharfen Enden ab, bis sie vollständig flach mit der Glasoberfläche sind, und schneiden Sie dann ein doppelseitiges Band mit dem Kanalmuster darauf.
Kleben Sie die auf die Glasträger auf der flachen Seite. Kleben Sie den beschichteten Deckblatt auf das Doppelband und drücken Sie darauf, um die Probenkammer dicht zu versiegeln und sicherzustellen, dass die beschichtete Seite nach innen zeigt. Schalten Sie den Computer und den Mikroskopschalter ein.
Starten Sie die Lasersteuerungsschnittstelle und schalten Sie den Laser ein. Drücken Sie die Aktivierungstaste an der Lasersteuerbox, um den Laser aufzuwärmen. Schalten Sie die Kameras ein und starten Sie dann das mikroskopbezogene Softwareprogramm.
Klicken Sie auf die obere Verschlussklappe und dann auf die Lampe. Bereiten Sie den TAM10 mit Tween-Puffer vor, indem Sie 10 Mikroliter 5% Tween-20 in einen Milliliter TAM10-Puffer hinzufügen. Bereiten Sie die Desoxylösung vor, indem Sie drei Milligramm Glukoseoxidase in einem kleinen Mikrozentrifugenröhrchen wiegen und 45 Mikroliter Katalase hinzufügen.
Wirbeln Sie das Rohr vorsichtig vor, um den Feststoff aufzulösen. Drehen Sie bei 20.000 mal G in einer Mikrozentrifuge für eine Minute und nehmen Sie den Überstand. Bereiten Sie 30% ige Glukoselösung, 200 Millimolar trolox-Lösung und 0,5 Milligramm pro Milliliter Streptavidinlösung gemäß den Anweisungen im Textmanuskript vor.
Fügen Sie dem Rasenobjektiv einen Tropfen Bildöl hinzu. Legen Sie die Probenkammern auf das Objektiv. Füllen Sie die Kammer mit 10 Mikrolitern Streptavidinlösung und warten Sie eine Minute.
Waschen Sie die Kammer mit 30 Mikrolitern TAM10 mit Tween-Puffer und sammeln Sie die Durchlauflösung mit einem gefalteten Filterpapier. Warten Sie eine Minute nach dem Waschen. Verdünnen Sie die Ribosomenkomplexe PRE oder POST auf 10-15 nanomolare Konzentrationen mit TAM10 mit Tween-Puffer.
Laden Sie 20 Mikroliter der Ribosomenprobe in den Kanal und warten Sie zwei Minuten. Machen Sie den Bildgebungspuffer mit 50 Mikrolitern TAM10-Puffer und jeweils 0,5 Mikrolitern Desoxyglucose und Trolox-Lösung. Mischen Sie sie gut.
Spülen Sie die Kammer mit 30 Millilitern des Bildpuffers. Stellen Sie die Kamera für die Aufnahme von Bildern ein. Klicken Sie auf den oberen Verschluss und die Lampe auf aus.
Starten Sie die Kameraaufnahme und verteilen Sie die Bilder in drei Fenster, die zwei einzelne Kameras und das Overlay darstellen. Wählen Sie im Menü "Erfassen" die Option "Zeitraffer aufnehmen" aus, und klicken Sie dann auf "Automatisch erfassen". Legen Sie den entsprechenden Dateinamen, Dateipfad und die Anzahl der Schleifen fest und klicken Sie auf Jetzt ausführen.
Schließen Sie das Popup-Fenster, sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, und öffnen Sie dann die erfasste ND-Datei. Klicken Sie auf ROI, einfacher ROI-Editor und wählen Sie den Optionskreis. Wählen Sie den ROI auf dem Bild aus und klicken Sie auf Fertig stellen, wenn es fertig ist.
Klicken Sie auf Messung, Zeitmessung, um die Daten entweder als Diagramm oder als Tabelle anzuzeigen. Öffnen Sie die Registerkarte Export, um die Exportparameter festzulegen, und klicken Sie dann auf Exportieren, um die Dichten zu speichern. Öffnen Sie abschließend die Datei, die mit einer geeigneten Anwendung exportiert wurde.
Der Abstand vom L27-Markierungsrest zur A-Stelle oder P-Stelle tRNA beträgt 61 bzw. 52 Angström, was einer FRET-Effizienz von 0,47 bzw. 0,65 entspricht. Floreszenzdicken aus den Spender- und Akzeptorkanälen wurden abgerufen und als Zeitraffer aufgezeichnet. Nach dem Ausbleichen des Spenders näherten sich beide Spuren dem Ausgangswert, da keine Erregung direkt am Akzeptor auftreten konnte.
Nach dem Akzeptorbleichen nahm die Intensität des Spenders zu, da weniger Reaktionswege die Anregungsenergie ableiteten. Die einzelnen Ribosomen wiesen aufgrund der wackelnden Bewegung der tRNAs unterschiedliche Schwankungen auf, was zu Abstandsschwankungen zum L27 führte. Andere Methoden wie Puromycin-Assay, Assay, Toeprinting-Assay und Massenspezifikation ergänzen die Einzelmolekül-FRET-Methode und geben weitere Details zur Proteinsynthese preis.
Einzelmolekül-FRET hat eine breite Anwendung, da viele biologische Prozesse im Nanometerbereich und auf Millisekunden-Zeitskalen ablaufen. Durch das Markieren der richtigen Farbstoffe an den richtigen Positionen können viele andere Dynamiken aufgedeckt werden.
