Fret de molécula única pode capturar dinâmicas que acontecem a distâncias de nanômetros, que é a escala certa para o processo de biossíntese de proteína ribossômica. Ribossomo trabalha coordenando múltiplos fatores e componentes aostericamente, o que é intrinsecamente inhomogêneo. O método de uma molécula única pode rastrear cada ribossomo sem ser limitado por este efeito médio inhomogêneo.
Este método revelará como os antibióticos inibem a função ribossoma para desenvolver novas drogas para infecções bacterianas resistentes a medicamentos. Comece preparando o PRE misturando a mistura de iniciação EFTU, NOG e PAG na proporção de um para dois a dois a 37 graus Celsius por dois minutos. Após a incubação, purifique o PRE usando a ultracentrifugação de almofada de sucrose molar 1.1 durante a noite a 100.000 vezes G.Prepare o POST misturando a mistura de iniciação EFTU, WG e PHE em uma proporção de um a dois a 37 graus Celsius por 10 minutos.
Após a incubação, purifique o POST usando 1,1 almofada molar de sucrose ultracentrifugação durante a noite a 100.000 vezes G.Limpe as lâminas de vidro do microscópio contendo seis pares de orifícios de um milímetro de diâmetro e as tampas de vidro do microscópio número 1,5. Asse os slides limpos e as tampas a 300 graus Celsius por três horas e, em seguida, cubra o deslizamento com aminosalina. Em um capô laminar limpo, coloque uma mancha plana na superfície.
Solte cuidadosamente 60 microlitros da solução PEG na borda superior, em seguida, coloque outro deslizamento de tampa em cima dele, deixando o efeito capilar espalhar a solução entre eles garantindo que nenhuma bolha seja formada. Repita estes passos para mais dois pares de tampas. Guarde essas tampas em uma caixa de ponta vazia cheia de água e incuba-as por três horas no escuro.
Após três horas, separe as tampas, enxágue com água em três cadinhos consecutivos e purga com um fluxo de nitrogênio seco. Puxe pontas afiadas de pipeta através dos orifícios nas lâminas de vidro até que elas se encaixem firmemente. Raspe as pontas afiadas até que fiquem completamente planas com a superfície de vidro, em seguida, corte uma fita de cara dupla com o padrão do canal sobre ele.
Coloque as lâminas de vidro no lado plano. Coloque a tampa revestida na fita de rosto duplo e pressione-a para fazer um selo apertado da câmara de amostra, certificando-se de que o lado revestido está voltado para dentro. Ligue o computador e o interruptor do microscópio.
Inicie a interface de controle a laser e ligue o laser. Pressione o botão de habilitação na caixa de controle a laser para aquecer o laser. Ligue as câmeras e inicie o programa de software associado ao microscópio.
Clique no obturador superior e clique na lâmpada. Prepare o tam10 com tampão Tween adicionando 10 microlitrais de 5%Tween-20 em um mililitro de buffer TAM10. Prepare a solução de desoxia pesando três miligramas de glicose oxidase em um pequeno tubo de microcentrifuuge e adicione 45 microliters de catalase a ele.
Vórtice o tubo suavemente para dissolver o sólido. Gire a 20.000 vezes G em uma microcentrifuagem por um minuto e pegue o supernatante. Prepare 30% de solução de glicose, solução Trolox de 200 milimões e 0,5 miligramas por mililitro de solução streptavidin seguindo instruções no manuscrito do texto.
Adicione uma gota de óleo de imagem ao objetivo do gramado. Coloque as câmaras de amostra no objetivo. Encha a câmara com 10 microliters de solução streptavidin e espere por um minuto.
Lave a câmara com 30 microliters de TAM10 com tampão Tween, coletando a solução run-through com um papel filtro dobrado. Espere um minuto depois de lavar. Diluir os complexos ribossomos PRE ou POST para 10-15 concentrações nanomolar com TAM10 com tampão de interpolação.
Carregue 20 microliters da amostra de ribossomo no canal e espere por dois minutos. Faça o buffer de imagem usando 50 microliters de buffer TAM10 e 0,5 microliters cada uma da solução de desoxicose e Trolox. Misture-os bem.
Lave a câmara com 30 mililitros do tampão de imagem. Defina a câmera para adquirir imagens. Clique no obturador superior ligado e a lâmpada desligada.
Inicie a aquisição da câmera e espalhe as imagens em três janelas representando duas câmeras individuais e a sobreposição. No menu de aquisição, selecione capturar timelapse e, em seguida, clique em capturar automaticamente. Defina o nome do arquivo apropriado, o caminho do arquivo e o número de loops e clique em executar agora.
Feche a janela pop-up assim que a aquisição da imagem estiver concluída e, em seguida, abra o arquivo ND adquirido. Clique no ROI, editor simples do ROI e escolha o círculo de opções. Selecione o ROI na imagem e clique no acabamento quando estiver concluído.
Clique na medição, medição de tempo para mostrar os dados como um plot ou uma planilha. Abra a guia de exportação para definir os parâmetros de exportação e clique em exportar para salvar as intensidades. Por fim, abra o arquivo que foi exportado usando um aplicativo adequado.
A distância do resíduo de rotulagem L27 para o tRNA do local A ou P é de 61 ou 52 angstrom, respectivamente, correspondendo à eficiência do FRET de 0,47 e 0,65. As intensidades florescence dos canais doadores e aceitadores foram recuperadas e traçadas como timelapses. Após o branqueamento do doador, ambos os traços se aproximaram da linha de base porque nenhuma excitação poderia ocorrer diretamente no aceitador.
Após o branqueamento do aceitador, a intensidade do doador aumentou porque menos vias de reação dissiparam a energia de excitação. Os ribossomos individuais apresentaram diferentes flutuações devido ao movimento oscilante das tRNAs, que causaram flutuações de distância para o L27. Outros métodos como ensaio de puramicina, ensaio, ensaio de impressão de toeprint e especificação de massa são complementares ao método FRET de molécula única e revelam mais detalhes sobre a síntese proteica.
Fret de molécula única tem uma aplicação ampla porque muitos processos biológicos acontecem na faixa de nanômetros e em escalas de tempo de milissegundos. Ao marcar corantes adequados em posições adequadas, muitas outras dinâmicas podem ser reveladas.
