Этот протокол показывает производство трансгенной травяной совки с использованием системы трансформации на основе piggyBac. Мы надеемся, что эти методы принесут пользу улучшению трансформации не только у травяной совки, но и у чешуекрылых насекомых. Метод, описанный здесь, делает трансформацию зародышевой линии чешуекрылых насекомых-вредителей эффективной.
Продемонстрировать процедуру будет доктор Сиен Чен, постдокторант в моей лаборатории. Начните с помещения 12 мужских куколок и 12 женских куколок в коробку. Поместите 10%-ный раствор сахарозы в коробку для кормления взрослых.
Накройте коробку бумажным полотенцем. На второй день после эклозии подвергайте взрослых интенсивному свету в течение ночи. На третий день после эклозии переведите взрослых особей в темное место.
Соберите эмбрионы в течение двух часов после чрезмерного положения. Добавьте капли воды на лист бумажного полотенца со свежими яйцами, хранящимися в чашке Петри на льду. Аккуратно переложите яйца на стеклянную горку тонкой кистью и выровняйте их по одному на стеклянной горке.
Держите стеклянные горки с яйцами выровненными по льду перед микроинъекцией. Вводят смесь 200 нанограммов на микролитр EGFP на основе piggyBac, экспрессирующую плазмиду, 200 нанограммов на микролитр гиперактивной мРНК транспозазы piggyBac и стерильную дистиллированную воду в яйца, используя компенсационное давление автоматизированного микроинжектора. Держите введенные яйца при температуре 27 плюс-минус один градус Цельсия, 60 плюс-минус 10% относительной влажности до вылупления.
Кормите вылупившихся личинок на искусственной диете и переведите каждую личинку в одну маленькую чашку на ранней стадии творога и звезды. Соберите куколок и поместите в клетку около 150 самок и 150 самцов. Повесьте несколько кусочков бумажных полотенец размером 30 сантиметров на 15 сантиметров в клетку, чтобы собрать яйца.
Ежедневно собирайте бумажные полотенца с яйцами и храните яйца в соответствующих условиях до вылупления. Держите новорожденных личинок при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы обездвижить их, а затем перенесите их на ледяную пластину. Скрининг обездвиженных личинок новорожденных под флуоресцентным стереомикроскопом.
Выберите EGFP-положительных новорожденных, поднимите их до стадии куколки, примерно через две недели при температуре 27 плюс-минус один градус Цельсия. Гиперактивная мРНК-транспозазы piggyBac, синтезированная in vitro, была обнаружена с использованием 1% агарозного геля. Эмбрионы, введенные PDS, не показали сигнала EGFP, в то время как EGFP-экспрессирующие плазмиды и гиперактивные транспозазы piggyBac транспозазы, введенные мРНК, показали флуоресценцию EGP, что указывает на то, что конструкция piggyBac была успешной.
Личинки G1, полученные из яиц в результате самокрещивания взрослых особей G0, показали сильный сигнал EGFP. Фрагмент, содержащий промотор и фрагмент EGFP, был успешно амплифицирован с использованием геномной ДНК, выделенной из EGFP-положительных личинок в качестве шаблона. Однако тот же фрагмент не был обнаружен, когда геномная ДНК была выделена из личинок дикого типа в качестве шаблона.
Яйца для микроинъекции должны быть как можно более свежими и всегда должны храниться на льду перед микроинъекцией, чтобы замедлить их развитие. Этот метод прокладывает путь для исследователей, чтобы ответить на вопросы в функциональной геномике насекомых-вредителей и разработать методы генетического контроля для этого глобального вредителя.
