Этот протокол предоставляет два метода для мобилизации C.Elegans для выполнения in vivo кальция изображения мышц стенки тела. Этот метод может помочь ответить на вопросы, связанные с гомеостазом кальция и обработки кальция, а также доступный синапс в генетически урочищеном организме. Этот метод может обеспечить лучшее понимание механизмов, регулирующих гомеостаз кальция мышц, и может, следовательно, иметь важное значение в определении условий или молекулярных путей, которые влияют на возбуждение сокращения связи через неправильное регулирование кальция велосипеде.
Эти методы могут дать представление о таких областях исследований, как нейробиология, биология развития и клеточная биология. Эти методы могут быть адаптированы для изучения различных типов клеток и C.elegans, других связанных нематод, а также личинок филсафата. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так что экспериментатор может понять технику вскрытия, и быть в состоянии точно оценить кальция переходных от правильно обездвиженные животные.
Начните с настройки микроскопа для флуоресцентных изображений. Используйте научную камеру CMOS, способную к полной визуализации кадра на 100 герц для того, чтобы отслеживать быстрые изменения уровня кальция. Приобретение камеры управления и светодиодное флуоресцентное возбуждение с микроменеджерным программным обеспечением, работающим в ImageJ.
Используйте плагин электронной платформы с открытым исходным кодом, который подключается к внешней доске микроконтроллеров с открытым исходным кодом для управления внешними импульсами синхронизации, которые контролируют флуоресцентные возбуждения. Чтобы контролировать логику синхронизации, активируйте протокол приобретения микроменеджеров в программном обеспечении в соответствии с инструкциями производителей. Используйте два светодиода, чтобы стимулировать родопсин канала с синим светом и записывать изменения RCaMP.
Активировать родопсин канала с am LED с пиковой длиной волны приема 470 нанометров и фильтром полосы, и возбудить RCaMP со светодиодом с пиковой длиной волны приема 594 нанометров и фильтром полосы. Совместное освещение обоих светодиодов и передать свет на той же оптической дорожке с помощью дихроического пучка комбайна. Управление сроками светодиодной подсветки с твердотельные переключатели, контролируемые сигналами TTL в соответствии с рукописными направлениями, и установить интенсивность светодиодов с текущей контролируемой нагрузки шума линейных источников питания, а затем запрограммировать синий протокол моделирования света в симулятор.
В этом эксперименте включите моделирование синего света после двух секунд захвата RCaMP флуоресценции только и использовать поезд из пяти, двух миллисекунд синий свет импульсов с интервалом 50 миллисекунд для активации родопсин канала. При использовании препарата вскрытия, выполнить C.elegans вскрытия при слабом освещении. Поместите животных в рассечение блюдо с силиконовым покрытием крышки базы, которая наполнена одной миллимоле кальция внеклеточного раствора, подготовленного в соответствии с рукописными указаниями.
Клей вниз животных с помощью жидкой актуальной кожи клей с голубой окраской вдоль спинной стороны червя. И сделать боковой разрез кутикулы вдоль клея и червя интерфейс с помощью стеклянных игл. Используйте рот пипетки, чтобы очистить внутренние внутренности от полости червя, а затем склеить кутикулы лоскут животного подвергать брюшной медиальной мышцы стенки тела для визуализации.
При использовании нано-шарик подготовки, сделать расплавленный 5%Agra раствор с использованием дистиллированной воды до конечного объема 100 миллилитров. Используйте пипетку Pasteur, чтобы поместить каплю раствора расплавленной Агры на стеклянную горку и сразу же поместить второй стеклянный слайд поверх, используя мягкое давление, чтобы создать даже площадку Agra. Удалите верхнюю горку и примерно на четыре микролитера полистирола нано-бусины к середине колодки.
При слабом освещении добавьте четыре-шесть C.elegans в раствор нано-бусины, убедившись, что животные не лежат друг на друге, и осторожно поместите крышку сверху. Когда вы будете готовы к изображению, поместите подготовленный слайд или рассечение блюдо на микроскоп и найти и сосредоточиться на червя, используя 10 раз увеличение и тусклый яркое освещение поля. Переключитесь на 60-е увеличение в флуоресцентном возбуждении RCaMP, чтобы определить медиальной мышцы стенки тела желудочка, которая является передней к вульве и в правильной вокальной плоскости.
Затем измените путь изображения от окуляра к камере, вытащив переключатель и нажав в прямом эфире в программном обеспечении для получения данных. Нажмите кнопку ORI в программном обеспечении для сбора данных и создайте коробку вокруг мышцы, на которую основное внимание уделяется. На стимуляторе включите ранее запрограммированный путь стимуляции синего света, а затем нажмите Acquire на программное обеспечение для визуализации, чтобы захватить изображение.
Когда C.elegans выращиваются на все-транс сетчатки, успешно включения сетчатки и активации канала родопсин, кальций переходный может быть вызвано. Если животные не подвергаются воздействию все-транс сетчатки нет мышечного кальция переходных срабатывает. Этот протокол был использован для исследования потери функции sca-1 мутантов, которые влияют на саркоплазмический насос кальция reticulum, кодируемый геном sca-1.
Но, препарат вскрытия увеличивается в базовых уровнях флуоресценции RCaMP наблюдались у мутанта по сравнению с контролем, предполагая, что мутация нуждается в повышенных уровнях покоя цитоплазмического кальция. Было значительное снижение пиковых уровней кальция в мутантах sca-1 по сравнению с контролем. Тем не менее, никаких изменений не было замечено в поднял пиковое время или половину времени распада.
Важно отметить, что аналогичные результаты можно наблюдать с помощью менее технически сложной подготовки нано-шарик. Потеря функции slo-мутантов, которые нарушают кальций активированных больших калийных каналов были оценены для того, чтобы исследовать мутантов, которые косвенно влияют на обработку кальция в C.elegans. При измерении базовых уровней RCaMP мутанты демонстрировали повышенную флуоресценцию по сравнению с управлением.
При оценке кинетики переходного кальция не было замечено никаких изменений в пиковых уровнях кальция. Slo-1 (eg142) мутанты, однако, продемонстрировали значительно увеличенный подъем до пикового времени. Самый важный шаг, чтобы помнить при завершении процедуры, чтобы подготовить экспериментальных животных в все-транс сетчатки.
Без этого шага родопсин канала будет неактивным, предотвращая свет индуцированных переходных кальция от срабатывания. После этой процедуры, электрофизиология и поведенческий анализ может быть сделано для оценки функционального воздействия любых наблюдаемых изменений в гомеостаз кальция. Используя методы иммобилизации, изложенные здесь, прокладывает путь для дальнейшего исследования динамики кальция и демонстрирует, что сопоставимые результаты могут наблюдаться в ответ на оптогенетической стимуляции нейронов и захвата мышечного кальция переходных с использованием гораздо менее сложной техники иммобилизации бисера.
