Изучение белково-белковых взаимодействий дает понимание регуляции многих биологических процессов. Здесь мы демонстрируем процедуру, описанную Y John shoe and co. Рабочие в 2007 году, где авторы использовали BiFC в сочетании с FRET для проверки трехстороннего взаимодействия между тремя белковыми молекулами.
Тем не менее, мы включили измерения срока службы флуоресценции в эту процедуру для обоснования измерений FRET. Чтобы продемонстрировать трехстороннее взаимодействие, мы выбрали белок, который, как известно, гомодимеризуется. Кроме того, он также был проверен внутри компании для взаимодействия с датчиком кальция белка, называемого в этом протоколе С-белком.
Белки MNC взаимодействуют в цитоплазме. В этом методе два белка помечаются расщепленными белками YFP. Их взаимодействие приводит к реституции функциональных YFP, которые выступают в качестве акцептора FRET третьему взаимодействующему партнеру, который помечен CFP, выступающим в качестве донора FRET.
Начните с амплификации кодирующих последовательностей интересующих генов, которые в нашем случае являются генами M и C, путем ПЦР и клонируйте их в соответствующих входных векторах. Проверяйте клоны, которые выбраны на антибиотиках, содержащих пластины, путем рестрикции пищеварения и секвенирования ДНК. Мобилизуйте восстановленные CDS из входных клонов в векторы назначения.
Все векторы, используемые в этом эксперименте, перечислены в таблице первой. Наконец, трансформируйте клетки агробактерий GV3101 с векторами назначения путем электропорации. Здесь мы выращиваем растения Nicotiana Benthamiana еще от четырех до шести стадий листьев в контролируемых условиях в камере роста.
Подготовьте почвенную смесь, смешав почвенный, кокосовый торф и компост в соотношении 2:1:1. Выложите слой этой смеси толщиной в один дюйм в пластиковый лоток, чтобы сделать почвенный слой и насытить его небольшим количеством воды. Посыпьте почву около 200 семян и переложите ее в больший лоток, который составляет около одного сантиметра стоячей воды.
Накройте этот лоток полиэтиленовой пленкой, чтобы создать влагозащищенную камеру. Перенесите этот лоток в камеру роста, установленную при 23 градусах по Цельсию с 16-часовым световым и восьмичасовым темным циклом. Через две недели перенесите молодые саженцы в небольшие трех-четырехдюймовые горшки, содержащие насыщенную водой почвенную смесь.
Поместите эти горшки в пластиковые лотки и переложите их в камеру для выращивания еще на четыре недели. Для агроинфильтрации бактериальные штаммы должны быть свежевыращены и смешаны вместе со штаммом агробактерии P19 в соответствующих соотношениях. Начните эту процедуру с инокуляции штаммов агробактерий GV3101, содержащих конструкции BiFC и FRET из пластин полосы в 10 мл.
к отвару, содержащему соответствующие антибиотики. Кроме того, также инициируют культивирование штамма агробактерий P19, который добавляется для предотвращения глушения трансгенов. Накройте колбу алюминиевой фольгой и держите их в шейкере инкубатора, установите ее на 28 градусов по Цельсию при 170 оборотах в минуту в течение 16 часов.
После ночного роста перекладывают 1 мл. этих культур в одноразовый локоть для измерения оптической плотности на 600 нанометров с помощью спектрофотометра. Смешайте культуры соответствующего партнера BiFC и FRET, содержащие штаммы, так, чтобы конечный OD составлял 0,5, а P19 - 0,3 в общем объеме 2 мл.
Для достижения этих соотношений мы следуем формуле, показанной на экране для этих расчетов. Центрифугируйте смешанные культуры агробактерий при 3000G в течение пяти минут при комнатной температуре и осторожно выбросьте супернатант. Суспендировать гранулы по 2 мл.
инфильтрационный буфер. Возможно, вам придется использовать вихревой смеситель, чтобы полностью повторно приостановить клетки в однородной клеточной суспензии. После этого инкубируют трубки при комнатной температуре в темноте в течение трех часов.
Между тем, маркируйте каждый горшок для растений для строительной смеси, в которую он будет проникать. Наполните 1 мл. безигольчатого шприца агробактериальной смесью.
Осторожно, но плотно прижмите кончик шприца к абаксиальной стороне полностью расширенного листа, поддерживая лист с другой стороны. Осторожно толкайте плунжер до тех пор, пока раствор не заполнится в области листа, эквивалентной двум-трем размерам кончика шприца. Инфильтрируйте бактериальную смесь в четырех местах на одном листе и повторите эту процедуру для трех-четырех листьев для одного вида инфильтрации.
Кроме того, включите не менее двух растений на конструкцию для инфильтрации. Не забудьте протереть руки 70% спиртом или поменять перчатки, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение. Переложите все горшки в лоток и высиживайте в камере роста в том же состоянии роста.
Проверьте небольшую часть агрофильтрованного листа с помощью флуоресцентного микроскопа. Когда флуоресценция как от YFP, так и от CFP обнаруживается в клетках, переходите к конфокальному микроскопу для анализа BiFC FRET-FLIM. В нашем случае этот анализ проводился через три дня после агроинфильтрации.
Теперь, когда растения готовы к визуализации под микроскопом, вырежьте квадратные образцы листьев от пяти до 8 мм. от наконечника шприца и установите их на дистиллированную воду. Положите на него чистую крышку и запечатайте.
Визуализируйте эти образцы в конфокальном лазерном сканирующем микроскопе. В этой процедуре основой определения и количественной оценки взаимодействия между двумя белками является уменьшение времени жизни флуоресценции партнера-донора FRET при его взаимодействии с акцептором, которое используется для расчета эффективности FRET. Сложность в случае трехстороннего взаимодействия еще больше возрастает, поскольку акцептор FRET в этом случае представляет собой не одну молекулу, а расщепленную пару YFP BiFC, которая должна сначала быть восстановлена in vivo, чтобы стать функциональным флуорофором акцептора FRET.
Чтобы провести FRET-FLIM, мы должны определить время жизни флуоресценции донорских молекул, сначала самостоятельно, а затем в присутствии партнера FRET. Откройте приложение FLIM в конфокальном лазерном сканирующем микроскопе, запустите консоль и используйте подсчет фотонов с распознаванием образов для измерения времени флуоресценции. Выберите стандартный режим измерения подсчета всех фотонов.
Мы возьмем два вида агроинфильтрованных растений. Один, который имеет ген CCFP, а другой, который имеет CCFP вместе с MYFP, потому что взаимодействие M-белка уже было подтверждено с C-белком с использованием BiFC и Y2H, мы ожидаем хорошую эффективность FRET с этой взаимодействующей парой. Теперь мы сначала сканируем агроинфильтрованный лист CCFP и ищем ячейку, показывающую хорошую флуоресценцию CFP.
Настройки микроскопа отображаются на экране. Образец освещается при достаточной мощности лазера для достижения приблизительно 0,1 фотона на импульс. Для образцов с переменной интенсивностью флуоресценции мы захватим 50 кадров для сбора адекватных фотонов, необходимых для измерения срока службы.
Поскольку известно, что CFP демонстрирует два времени жизни флуоресценции из-за его подтверждающей адаптации, мы подаем данные, используя экспоненциальную модель реконволюции, сохраняя при этом значение N равным двум. В этих настройках два времени жизни видны через одну и 3,2 наносекунды. Мы будем использовать более высокий срок службы для всех последующих расчетов.
Теперь мы приступили к измерению FRET между CCFP и MYFP. Для этого воспользуемся образцом листьев агроинфильтрованного растения с CCFP и MYFP. Мы ищем ячейку, которая экспрессирует как CCFP, так и MYFP и подтверждает их соответствующие модели излучения, возбуждая их с помощью полного 40-нанометрового импульсного лазера и 514-нанометрового лазера белого света.
После этого мы переключаемся на консоль FLIM для измерения времени жизни CFP, используя те же настройки, которые мы использовали ранее для измерения времени жизни CCFP. Но на этот раз клетка также экспрессирует MYFP, который потенциально может взаимодействовать с CCFP и вызывать сокращение времени жизни CCFP. Когда мы прочитали график, полученный с использованием модели экспоненциальной реконволюции N с N, равным двум, на самом деле наблюдается уменьшение времени жизни CFP с 3,2 до 2,6 наносекунд.
Теперь мы запускаем консоль FRET в программном обеспечении и вычисляем эффективность FRET, вручную вводя неоспоримый срок службы в уравнение, представленное в программном обеспечении, и наблюдаемая эффективность FRET составляет 56% Теперь давайте перейдем к заключительному шагу, то есть визуализируем взаимодействие между тремя партнерами. Для этого мы берем образец листьев у растения, которое было совместно инфильтрировано CCFP и MYFPN с MYFPC. Мы сканируем листовое растение на наличие клетки, которая показывает как CFP, так и восстановленную флуоресценцию YFP, исходящую от взаимодействия между двумя M-белками.
Мы используем тот же лазер и длину волны излучения, что и ранее. Впоследствии отключаем 514-нанометровый лазер и переходим к консоли FLIM. Если димер MYFP взаимодействует с CCFP.
Мы должны увидеть сокращение срока службы ККФП, наблюдаемое во время его взаимодействия с МРФП. Однако, если CCFP не взаимодействует с димером MYFP, его время жизни флуоресценции должно оставаться на уровне 3,2 наносекунды. Используя аналогичные настройки, как упоминалось выше, мы измеряем время жизни CFP в присутствии восстановленного YFP.
Подгоняем граф с помощью модели экспоненциальной реконволюции N с равным двум и переходим к консоли FRET. И да, наблюдается снижение времени жизни CFP с 3,2 до 2,3 наносекунд. Мы рассчитываем эффективность FRET, как описано выше.
Расчетная эффективность FRET составляет 55% Здесь мы использовали FLIM для измерения срока службы флуоресценции партнера-донора FRET в присутствии и отсутствии акцептора FRET. Ожидалось сокращение времени жизни флуоресценции донора, если между двумя белками наблюдалось положительное взаимодействие. В случае позитивного контроля это ККФП и МРФ.
Мы наблюдаем снижение времени жизни флуоресценции донора с 3,3 до 2,5 наносекунд, а эффективность FRET составила 56% Аналогичное упражнение с восстановленным YFP в результате взаимодействия между двумя амономерами и С-белками также привело к положительному взаимодействию FRET, ведущему к сокращению времени флуоресценции донора до 2,6 наносекунд. Расчетная эффективность FRET в этом случае составила около 55%. Сокращение времени жизни флуоресценции донора FRET является убедительным доказательством трехстороннего взаимодействия между этими белками.
Протокол, описанный здесь, является мощным инструментом для определения трехсторонних белково-белковых взаимодействий в живых клетках. Эта процедура также может помочь определить внутриклеточную локализацию полученных комплексов, что важно при расшифровке функции и физиологического значения любого белкового комплекса. В заключение, анализ FRET-FLIM на основе BiFC дает возможность изучить и охарактеризовать важные аспекты трехсторонних белковых взаимодействий, которые могут быть полезны в исследованиях белково-белкового взаимодействия как в животных, так и в растительных системах.
