Авторы хотели бы поблагодарить Тиффани Вишня в ее помощи в оптимизации этого протокола. Эта работа финансировалась Национальным институтом старения (AG032320), а также продвижение здоровой Висконсин.

См. на рисунке 1 представлена ​​основная схема процедуры, начиная с гомогената. Расчетное время от подготовки клеточные экстракты для вымывания CAM-связанных белков составляет около шести-семи часов. 1. Ткань подготовки <ol><li> Inject органотипической срезах гиппокампа с вирусом, содержащим плазмиду выражения рекомбинантный белок (в данном примере, зеленый флуоресцентный белок (GFP), помеченные Ng) и позволяют ткани, чтобы выразить белка в одночасье. </li><li> Приблизительно от 12 до 18 часов после вирусной инъекции (в зависимости от вирусного время выражение), подготовить для сбора ткани. Добавить 1 мл буфера рассечение (10 мМ глюкозы, 4мм KCl, 26 мм NaHCO3, 233mM сахарозы, 5 мМ MgCl 2, 1 мМ CaCl 2 и 0,1% фенол-красный, газовые камеры с 5% CO 2 95% O 2) в чашке Петри. Передача культурной ткани / вставить в чашку Петри и добавляют 2 мл буфера для вскрытия вставить, чтобы погрузиться ткани. </li><li> Сборт органотипической гиппокампа ткани (от 5 до 10 ломтиков), аккуратно очищая ткани без вставки мембраны с помощью скальпеля. В частности удаления конкретном регионе интерес (например, СА1) тоже вариант. Передача приостановлено ткани 1,5 мл трубки микроцентрифужных использованием перевернутой пипетки Пастера. </li><li> Центрифуга образцов при 1500 RCF в течение 1 мин отделить ткани от вскрытия буфера. Осторожно удалите супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не потревожить осадок. </li><li> Для каждого среза используется, добавить от 30 до 60 мкл гомогенизации буфера (150 мМ NaCl, 20 мМ Трис рН 7,5, 1 мМ DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL антиболевой, 1μg/mL пепстатина, и 1% Тритон Х -100), чтобы ткани и гомогенизации полностью с пестиком. </li><li> Для того, чтобы удалить продукты распада клеток, центрифуга оставшегося гомогената при 1100 RCF в течение 10 мин и осторожно удалите супернатант аспирацией, избегая при этом загрязнения из гранул. </li><li> Возьмите 10% супернатант в качестве образца на входе (образец 1). Магазин оставшиеся супернатант на льду во время подготовки CAM-сефарозе шарики для использования в шаге 3. </li></ol> Примечание: ткани, используемые здесь, органотипической срезах гиппокампа. Тем не менее, можно использовать диссоциированных нейронов или любой другой системы культивирования клеток. В таком случае, начнем с пункта 1.4 после сбора вашей ткани в соответствующей манере. 2. Подготовка шарики для выпадающем При работе с бисером, очень важно, чтобы спасти бисером и максимизировать эффективность реакции, предотвращая бусы из сушки по бокам трубки. Чтобы это сделать, то лучше, чтобы повернуть трубы на их стороне, что позволяет решению на влажные бусины на стенках трубки, непосредственно перед центрифугированием. <ol><li> Для каждого выпадающего, пипетки 400 мкл взвешенных кальмодулин-сефарозой бусины в 2 мл микроцентрифужных трубка с относительно FLAт-снизу максимально площадь поверхности и взаимодействие своих решений с бисером во время инкубации. </li><li> Центрифуга бус на 21000 RCF в течение 30 секунд и осторожно удалите супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не потревожить бисером. </li><li> Для мытья бисером, добавить 100 мкл соответствующего буфера гомогенизации, содержащие либо 2 мМ CaCl 2 для тех, которые используются для выпадающем Ca 2 +-СаМ связывающих белков и 2 мМ ЭДТА (известный Са 2 + хелат) для бисера снос ApoCaM связывающих белков. Слегка нажмите на трубке повторно приостанавливать бисером и центрифуге при 1500 RCF в течение 1 мин. Осторожно удалите супернатант аспирацией, убедившись, что не нарушить бисером. </li></ol> Примечание: Для всех шагов стремление, то рекомендуется использовать пипетки, которая прекрасно открытия (например, советы гель загрузки), чтобы разрешить удаление решение, не снимая бусы. 3. CAM-сефарозе связывания белков <ol><li> Разделите на два супернатант условиях, содержащих равный объем. В зависимости от вашего состояния, добавить соответствующее количество CaCl 2 или ЭДТА к надосадочной до 2 мм концентрации для каждого. </li><li> Добавить супернатант, начиная с шага 1,7 до бисер промывали в соответствующие буфера гомогенизации. Слегка нажмите на трубке, чтобы смешаться. </li><li> Инкубируйте образцы при температуре 4 ° С в течение 3 часов на шейкере. Повторное приостановить бисером каждые 30 минут или около того, чтобы повысить эффективность связывания. </li><li> Одноразовая пробирка с образцами и бусы в 1500 RCF в течение 3 мин. </li><li> Возьмите 50 мкл надосадочной в качестве образца несвязанных белков (образец 2) и осторожно удалите оставшиеся супернатант аспирацией и выбросьте. </li><li> Вымойте бусин в три раза, как описано в пункте 2.3 с 100 мкл соответствующего буфера гомогенизации. </li></ol> 4. Элюирование <ol><li> Добавить 50 мкл элюирующего буфера (50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, и 150 мМ NaCl), содержащий противоположные условия (10 мМ CACL 2 или 10 мМ ЭДТА) на бусы. Например, образцы, которые были связаны гомогенизируют и в буфере, содержащем Ca 2 + вымываются в элюции буфера, содержащего ЭДТА и наоборот. </li></ol> Дополнительно: Потепление элюции буфера до 37 ° С перед добавлением бисера может повысить урожайность. <ol start="2"><li> Инкубируйте решение бисером при комнатной температуре в течение 30 минут на шейкере. Смешайте бисер аккуратным постукиванием трубки примерно каждые 5 мин. </li><li> Центрифуга бус на 1500 RCF в течение 3 мин и осторожно удалите 50 мкл надосадочной для связанного белка (образец 3) стремлением. Убедитесь в том, чтобы не потревожить бисером. </li><li> Добавить буфера белка загрузки всех образцов (т.е. гомогената, несвязанных и связанных белков, а также тех, кто еще связан с бисером). </li></ol> Примечание: Для обеспечения максимальной элюирования (особенно в случае неэффективного элюирования), добавить 50 мкл соответствующего буфера элюирования (например, добавление ЭДТА содержащих буферефер, чтобы бусины связаны в CaCl 2), чтобы бисер перед нагреванием образцов, чтобы помочь элюировать оставшиеся белком и повторить шаги, описанные в 4.3, чтобы удалить остатки связанных белков. 5. SDS-PAGE и Вестерн-блот Поведение SDS-PAGE и анализировать использование западных пятно с помощью зондирования для белок и зонд для белок, известный связывать СаМ в противоположном состоянии, положительного контроля. 6. Представитель Результаты Рисунок 2B показывает пример CAM-выпадающем анализа тестирования обязательные веб-камера GFP с метками Ng по сравнению с эндогенным Ng. Чтобы сделать это, GFP-Нг был избыточно экспрессируется в нашей органотипической срезах гиппокампа в ночное время и ткани гомогенизировали. Гомогенат инкубировали с CAM-сефарозе бусины в присутствии либо Ca 2 + или ЭДТА. Гомогената вход показывает, что GFP-Ng была выражена в дополнение к эндогенным Нг и Са 2 + / CAM-зависимой киназы II(CaMKII). Как и ожидалось на основе известных связывание эндогенного Нг (показано на рис. 2A), GFP с метками Ng элюировали в отсутствие Са 2 + (ЭДТА связанного белка) и несвязанного в присутствии ионов Са 2 + (рис. 2В) . В отличие от контроля, CaMKII, элюировали только в присутствии ионов Са 2 + (белком) и несвязанных в его отсутствие (ЭДТА). Это показывает, что СаМ шарики функционирует нормально, и elutions были эффективными. Самое главное, это показывает, что GFP-Ng связывается с ApoCaM в аналогии с эндогенной форме, предполагая, что теги GFP не изменило функции нашего рекомбинантного белка. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="Рисунок 1"/> Рисунок 1. Очерк СаМ выпадающего анализа (А) гомогената ткани вращается вниз, чтобы удалить продукты распада клеток. Около 10% надосадочной взят как образец мощность (1). Остальные супернатант делится поровну на различныхусловий и соответствующих реагентов (CaCl 2 или ЭДТА) добавляются в тест обязательным в таких условиях. Каждый супернатант (содержащие либо CaCl 2 или ЭДТА) загружается на соответственно подготовленных CAM-сефарозе бисером и (Б) инкубировали чтобы обязательными. Свободные белки удаляются (2) и (C) связанных белков (3), элюировали из бисера использованием элюирующего буфера (EB), содержащий противоположное условие, как обязательные. Белкового состава этих трех образцов белка могут быть проанализированы с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блот анализа. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="Рисунок 2"/> Рисунок 2. A.) Схема Ca 2 +-зависимый СаМ обязательными и элюирования в выпадающем Примеры анализа даны два типа белков, которые связываются камеры в Ca 2 +-зависимым образом. Neurogranin (Ng) представляет собой белки, которые связываются апо-CAM и CaMKII представляет белков, которые связываются с Са 2 +-богатыхCAM. СаМ показана в ее состоянием диссоциации до инкубации с гомогената белков. После инкубировали в условиях высоких Са 2 + концентраций (2 мм) или в присутствии Са 2 + хелатором, ЭДТА (2 мМ), белки связываются с СаМ соответственно. Ng связывает камеры в условиях ЭДТА как там практически нет Са 2 + подарок, и будет элюировали CAM-сефарозе бусин в присутствии ионов Са 2 +. CaMKII, однако, будет связываться с камеры в наличии большое количество Са 2 + и будет отделить один раз Са 2 + был хелатные. Б) Результаты Например СаМ выпадающего анализа. Эта цифра демонстрирует ожидаемый конечный результат CAM-сефарозе тянуть вниз образцы исследовали на Нг и CaMKII. Оба эндогенных Нг и GFP-Ng присутствуют в полосы белки, которые связываются СаМ в присутствии ЭДТА. Нет Нг обязан, когда образцы инкубировали с камеры в присутствии ионов Са 2 +, демонстрируя, что Nг только связывает апо-CAM. Наш положительный контроль, CaMKII, с другой стороны, связывает СаМ только в присутствии ионов Са 2 +.

<ol>
	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

При условии, протокол использует CAM-сефарозе бусин для расследования Ca 2 +-зависимость CAM-связывающих белков. Многие белки связываются камеры в Ca 2 +-зависимым образом. Эти взаимодействия имеют большое значение, учитывая количество CAM-связывающих белков и их важную роль во мно?...

<table border="1"><tr><td> Продукт </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Примечания </td></tr><tr><td> Кальмодулин-сефарозой бисером </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Анти-альфа CamKII </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Анти-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Гель Советы Загрузка Пипетируйте </td><td> Рыболов </td><td> 02-707-138 </td><td> Используйте для аспирации супернатанты </td></tr><tr><td> Микроцентрифуга труб (2,0 мл) </td><td> Рыболов </td><td> 05-408-146 </td><td> Использовать для всех шагов с участием кальмодулин-сефарозой бисером </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the calcium-binding protein known as calmodulin (CaM)1,2. CaM is involved at multiple levels in almost all cellular processes, including apoptosis, metabolism, smooth muscle contraction, synaptic plasticity, nerve growth, inflammation and the immune response. A number of proteins help regulate these pathways through their interaction with CaM. Many of these interactions depend on the conformation of CaM, which is distinctly different when bound to Ca2+ (Ca2+-CaM) as opposed to its Ca2+-free state (ApoCaM)3.
While most target proteins bind Ca2+-CaM, certain proteins only bind to ApoCaM. Some bind CaM through their IQ-domain, including neuromodulin4, neurogranin (Ng)5, and certain myosins6. These proteins have been shown to play important roles in presynaptic function7, postsynaptic function8, and muscle contraction9, respectively. Their ability to bind and release CaM in the absence or presence of Ca2+ is pivotal in their function. In contrast, many proteins only bind Ca2+-CaM and require this binding for their activation. Examples include myosin light chain kinase10, Ca2+/CaM-dependent kinases (CaMKs)11 and phosphatases (e.g. calcineurin)12, and spectrin kinase13, which have a variety of direct and downstream effects14.
The effects of these proteins on cellular function are often dependent on their ability to bind to CaM in a Ca2+-dependent manner. For example, we tested the relevance of Ng-CaM binding in synaptic function and how different mutations affect this binding. We generated a GFP-tagged Ng construct with specific mutations in the IQ-domain that would change the ability of Ng to bind CaM in a Ca2+-dependent manner. The study of these different mutations gave us great insight into important processes involved in synaptic function8,15. However, in such studies, it is essential to demonstrate that the mutated proteins have the expected altered binding to CaM.
Here, we present a method for testing the ability of proteins to bind to CaM in the presence or absence of Ca2+, using CaMKII and Ng as examples. This method is a form of affinity chromatography referred to as a CaM pull-down assay. It uses CaM-Sepharose beads to test proteins that bind to CaM and the influence of Ca2+ on this binding. It is considerably more time efficient and requires less protein relative to column chromatography and other assays. Altogether, this provides a valuable tool to explore Ca2+/CaM signaling and proteins that interact with CaM.

Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Кальмодулин (CAM) выпадающее анализ является эффективным способом для исследования взаимодействия СаМ с различными белками. Этот метод использует CAM-сефарозе шарики для эффективного и конкретного анализа CAM-связывающих белков. Это является важным инструментом для изучения СаМ сигнализации в функционирование клетки.

Раскрывающееся кальмодулина-связывающие белки

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

25.2K Views.  Medical College of Wisconsin. Кальмодулин (CAM) выпадающее анализ является эффективным способом для исследования взаимодействия СаМ с различными белками. Этот метод использует CAM-сефарозе шарики для эффективного и конкретного анализа CAM-связывающих белков. Это является важным инструменто...

Video: Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Электрофоретического разделения белков

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Окрашивание белков в гелях

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Микроконтактной печати белков для клеточной биологии

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Экспрессия рекомбинантных белков в метилотрофных дрожжей Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Кристаллизация Мембранные белки в липидных Мезофазы

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

Высокая пропускная способность очистки Affinity с метками рекомбинантных белков

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Жить Визуализация GFP-меченых белков в<em&gt; Drosophila</em&gt; Ооцитов

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Кратковременная экспрессия белков гидродинамическими доставки генов у мышей

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).