В последние годы инкапсуляция в липидных двухслойных везикулах размером с клетку оказалась полезным методом для экспериментов по восстановлению in vitro. Метод, который мы представляем, значительно поможет с восстановлением цитоскелета в исследованиях синтетических клеток. С помощью этого метода мы можем генерировать гигантские одноцветные везикулы неоднородного размера с высокой урожайностью.
Время генерации пузырьков значительно уменьшено по сравнению с обычной техникой cDICE. Мы можем инкапсулировать бесклеточные системы транскрипции-трансляции, изолированные от сложных, одновременно происходящих клеточных процессов, для изучения молекулярных путей. Этот метод может быть использован для сборки минимальных протоклеток для создания функциональных синтетических клеток.
Начните приготовление масляно-липидной смеси, перенеся диолеоил-фосфохолин, холестерин и родамин ПЭ в 15-миллилитровый стеклянный флакон. Затем добавьте во флакон 0,5 миллилитра хлороформа. Пипетка 7,2 миллилитра силиконового масла и 1,8 миллилитра минерального масла в отдельной 15-миллилитровой трубке и смешивание масел путем вихря со скоростью 3 200 оборотов в минуту в течение 10 секунд.
Затем добавляют масляную смесь во флакон, содержащий смесь липидов и хлороформов, и вращают смесь со скоростью 3 200 оборотов в минуту в течение 10-15 секунд, пока полученная смесь липидов в масле не станет слегка мутной, так как липиды не полностью растворены в масле. Далее обрабатывают липид ультразвуком в масляной дисперсии в ультразвуковом аппарате с ультразвуковой мощностью 80 Вт и рабочей частотой 40 килогерц в течение 30 минут при комнатной температуре. Если не используется немедленно, храните липидно-масляную смесь при четырех градусах Цельсия в течение 24 часов.
Для генерации пузырьков используйте узел с 3D-печатным валом из черной смолы, установленным на настольной перемешиваемой пластине со скоростью 1 200 оборотов в минуту. Затем установите 3D-печатный непрерывный интерфейс капель, пересекающий инкапсуляцию, или камеру cDICE, изготовленную из прозрачной смолы на валу черной смолы. Готовят от 1 до 10-микромолярного раствора актина в глобулярном актиновом буфере, или G-буфере, включая 10%-ный актин АТО 488.
Чтобы начать полимеризацию актина, добавьте нитевидный буфер полимеризации актина, или F-буфер, в раствор актина на льду, а затем держите растворы на льду, чтобы замедлить полимеризацию актина перед добавлением сшивателя. Для получения актин-связывающих белков, или ABP, из 1,75 миллиграмма на миллилитр запаса фасцина, аликвот 1,57 микролитра фасцина в отдельной микропробирке. Затем добавляют 7,5% среды градиента плотности в раствор актина, чтобы создать градиент плотности между внешней и внутренней водной фазой и облегчить гигантские одноцветные везикулы или ГУВ, осаждение.
Затем дозируйте 700 микролитров 200-миллимолярной глюкозы в качестве внешнего раствора в камеру. Добавьте достаточное количество липидно-масляной смеси в камеру до тех пор, пока не будет заполнено от 60% до 80% камеры. Между липидно-масляной смесью и наружным раствором образуется интерфейс.
Готовят смесь актин-АБП путем переноса АБП в раствор актина. Затем используйте обычную пипетку от 100 до 1000 микролитров для переноса 700 микролитров липидно-масляной смеси в смесь актин-ABP. Пипетка вверх и вниз восемь раз для получения липидных монослойных эмульсионных капель размером с клетку диаметром от 7 до 100 микрон.
Используйте ту же пипетку от 100 до 1000 микролитров, чтобы дозировать всю эмульсию во вращающуюся камеру. Капли приобретают второй листок липидов, пересекая монослой липидов на границе раздела масло-внешний раствор, тем самым образуя ГУВ. Когда это будет сделано, извлеките камеру из перемешиваемой пластины и выбросьте большую часть липидно-масляной смеси, наклонив камеру в контейнере для отходов.
Удерживая камеру крышкой, обращенной внутрь, откройте крышку камеры и слегка наклоните камеру внутрь. Граница раздела между наружным раствором, содержащим ГУВ, и липидно-масляной смесью будет видна из отверстия камеры, где расположена крышка. Используйте пипетку для сбора достаточного количества наружного раствора, содержащего ГУВ, и дозируйте от 50 до 300 микролитров наружного раствора в 96-луночную пластину для получения соответствующей плотности ГУВ.
Для визуализации ГУВ установили 96-луночную пластину на сцене инвертированного микроскопа, оснащенного масляным погружным объективом 60X. Откройте интересующую последовательность изображений в программном обеспечении для обработки изображений ImageJ Fiji и определите изображение с наибольшей интенсивностью. Удерживайте клавишу Control Shift C, чтобы открыть окно яркости и контрастности, и перейдите на вкладку сброса.
В меню ImageJ Fiji перейдите на вкладки Анализ и установка масштаба, чтобы ввести известное физическое расстояние и единицу измерения для каждого пикселя изображения. После этого перейдите к кнопкам Изображение, Стеки, а затем 3D-проект, чтобы восстановить 3D-изображение из стека Z. Задайте для метода проекции значение Точка яркости, интервал между фрагментами — 0,5 микрометра, а затем установите флажок Интерполировать.
Используйте параметры по умолчанию для остальных настроек и записи изображений. Репрезентативное изображение демонстрирует конфокальное изображение ГУВ, меченных родамином PE, с инкапсулированными фасцин-актиновыми пучками. Перенос актин-связывающих белков в раствор актина, затем добавление липидно-масляной смеси и генерация липидных монослойных капель должны происходить за несколько секунд, чтобы избежать образования актиновых сетей перед инкапсуляцией.
Мы использовали этот модифицированный метод cDICE для изучения роли различных сшивающих агентов в организации актиновых сетей. Мы ожидаем, что этот метод поможет другим исследователям изучить регуляцию других белков цитоскелета.
